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针对上述问题，四川大学程冲、成都中医药大学附属医院陈秋、四川轻化工大学穆盛东团队受天然锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）三维配位结构、活性中心及抗氧化酶中单原子/簇协同位点启发，全新设计并构建了锰有机配合物负载钌簇（MnCP-Ru）人工金属酶，顺利获得锰单原子与钌簇的协同催化实现级联ROS清除，在细胞与动物水平均展现出优异的脑缺血再灌注损伤修复效果。该文章于2026年5月6日以《Metal-Organic Complex-Engineered Artificial Metalloenzymes With Synergistic Site and Cascade ROS Elimination to Treat Cerebral Ischemic-Reperfusion Injury》为题发表于《Angewandte Chemie International Edition》（DOI：10.1002/anie.1441985）。

图1. MnCP-Ru生物催化剂的设计及治疗脑缺血再灌注损伤的机制示意图。

（1）MnCP-Ru的设计与结构表征

顺利获得一步水热反应，以锰盐与1,3,5-均苯三甲酸（BTC）制备Mn-有机复合物（MnCP），随后引入Ru离子得到MnCP-Ru人工抗氧化酶。扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）显示，MnCP-Ru保持明确的球形结构，直径约450 nm。原子分辨率高角环形暗场扫描透射电子显微镜（HAADF-STEM）图像显示，Ru团簇被原子级分散的Mn原子包围，能量色散X射线光谱（EDS）mapping表明Ru团簇主要分布在MnCP exterior，平均尺寸约0.88 nm。傅里叶变换红外（FT-IR）光谱揭示MnCP-Ru中存在类似天然Mn-SOD的COO⁻结构。扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）及小波变换（WT）分析表明，Ru团簇外围Ru原子与BTC配体的COO⁻基团存在相互作用，形成Ru-Ru和Ru-O键。Ru K边X射线吸收近边结构（XANES）光谱显示，MnCP-Ru的预边峰位于Ru箔与RuCl₃之间，平均氧化态为+2.3。X射线光电子能谱（XPS）进一步证实MnCP-Ru中存在Run⁺氧化态与Ru⁰，且Mn物种相对于MnCP呈现结合能正移，表明电子从MnCP向Ru位点发生转移，有利于克服Ru位点上氧物种的多电子反应，实现高效氧化还原平衡。

图2. MnCP-Ru人工生物催化剂的设计与结构表征。a) MnCP和仿生MnCP-Ru的合成过程示意图，蓝色、紫色、红色、灰色和浅青色球分别代表Mn、Ru、O、C和H原子。b) MnCP-Ru的TEM图像。比例尺，500 nm。c) MnCP-Ru的原子分辨率HAADF-STEM图像，绿色圆圈标注Ru团簇，黄色圆圈标注单原子Mn。比例尺，2 nm。d) MnCP-Ru的EDS元素分布图。比例尺，5 nm。e) MnCP-Ru的EDS能谱。f) MnCP-Ru上Ru团簇的直径分析，平均直径0.88 nm。g) MnCP-Ru和MnCP的FT-IR光谱。h) Ru K边k²加权傅里叶变换EXAFS光谱。i) 不同样品Ru K边EXAFS的WT图像。j) MnCP-Ru及参比材料（Ru箔、RuCl₃、RuO₂）的Ru K边XANES光谱。k) MnCP-Ru中Ru物种的价态分析。l) 不同样品的高分辨Ru 3p XPS。m) 不同样品的高分辨Mn 2p XPS。

（2）MnCP-Ru的酶模拟ROS消除活性

MnCP-Ru表现出广谱自由基清除能力。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）清除实验显示，MnCP-Ru对多种自由基具有快速清除能力，优于C-Ru和裸MnCP。在·OH清除方面，MnCP-Ru的催化能力显著强于对照组。SOD-like活性检测显示，MnCP-Ru与MnCP在5分钟内对·O₂⁻的消除率均约80%，表明MnCP类似天然SOD的3D配位结构对·O₂⁻清除至关重要。CAT-like反应中，MnCP-Ru在30分钟内显著降低H₂O₂浓度（约80%），性能优于C-Ru和裸MnCP。以硫氰酸钾（KSCN）进行金属位点毒化实验后，MnCP-Ru的CAT-like和SOD-like活性均显著下降，证实Ru和Mn中心是消除ROS的必需活性位点。溶氧仪检测显示，MnCP-Ru在5分钟内使O₂浓度从7.04升至30.62 mg/L，产氧速率显著快于C-Ru和MnCP。Michaelis-Menten动力学拟合显示，MnCP-Ru的最大反应速率（Vmax）和转换数（TON）远高于C-Ru及文献报道的先进生物催化剂。密度泛函理论（DFT）计算表明，MnCP-Ru对O₂的吸附能低于C-Ru和纯Ru团簇，具有更强的O₂释放能力，与Km结果一致。

图3. MnCP-Ru生物催化剂的酶模拟ROS消除活性。a) MnCP-Ru顺利获得级联抗氧化活性消除ROS的示意图。b) MnCP-Ru、C-Ru和MnCP对DPPH·的消除率（n = 3）。c) 不同材料对·OH的消除率（n = 3）。d) 不同材料的类SOD活性（n = 3）。e) 不同材料类CAT活性的时间依赖性曲线。f) 不同材料对H₂O₂的消除率（n = 3）。g) 顺利获得KSCN对MnCP-Ru进行的活性位点毒化实验（n = 3）。h) 在生物催化剂和H₂O₂存在下，溶氧仪测定的O₂产生浓度。i) 以H₂O₂为底物，MnCP-Ru和C-Ru的Michaelis-Menten动力学分析及Lineweaver-Burk双倒数图。j) MnCP-Ru和C-Ru的Vmax、Km和TON值。k) 与此前报道的生物催化剂的Vmax和TON对比分析。l) 不同样品与O₂相互作用的结构模型。m) 不同样品对*O₂中间体吸附的计算吸附能。数据以平均值±SD表示。统计学显著性顺利获得Student t检验和单因素方差分析评估。

（3）MnCP-Ru对PC12细胞的保护作用

在H₂O₂或·O₂⁻诱导的PC12细胞氧化应激模型中，MnCP-Ru展现出显著的细胞保护效果。2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光检测显示，H₂O₂（200 μM）和·O₂⁻（1/2标准浓度）处理使细胞内ROS水平显著升高，呈现明亮的绿色荧光；而MnCP-Ru（50 μg mL⁻¹）与细胞共培养后，荧光强度明显减弱。TEM观察证实MnCP-Ru可被PC12细胞吞噬并进入细胞器。流式细胞术定量分析显示，MnCP-Ru处理后H₂O₂和·O₂⁻损伤细胞的ROS生成水平显著降低。Annexin V与碘化丙啶（PI）双染实验表明，H₂O₂诱导的PC12细胞晚期凋亡率为48.2%，MnCP-Ru共处理后降至34.0%；·O₂⁻诱导的晚期凋亡率为65.4%，MnCP-Ru处理后降至31.7%。上述结果表明，MnCP-Ru能有效减轻ROS诱导的细胞损伤，显著降低神经元样细胞凋亡。

图4. MnCP-Ru对PC12细胞抵抗H₂O₂和·O₂⁻诱导氧化损伤的保护作用。a) DCFH-DA探针检测H₂O₂损伤PC12细胞的一般ROS荧光图像。比例尺，100 μm。b) DCFH-DA探针检测·O₂⁻损伤PC12细胞的一般ROS荧光图像。比例尺，100 μm。c) MnCP-Ru内化于PC12细胞的TEM图像，PC12细胞与MnCP-Ru（50 μg mL⁻¹）共孵育4小时。比例尺，500 nm。d) MnCP-Ru清除H₂O₂和·O₂⁻保护PC12细胞的示意图。e) H₂O₂（200 μM）损伤PC12细胞的一般ROS定量分析。f) ·O₂⁻（1/2标准浓度）损伤PC12细胞的一般ROS定量分析。g) 流式细胞仪检测H₂O₂损伤PC12细胞的ROS水平定量。h) 流式细胞仪检测·O₂⁻损伤PC12细胞的ROS水平定量。i) Annexin V/PI染色流式细胞术分析PC12细胞凋亡。j, k) 各处理组Annexin V阳性细胞比例的定量分析，数据来自每组n = 5次独立实验。对照组：无特殊处理；ROS条件：200 μM H₂O₂或1/2标准浓度·O₂⁻处理；MnCP和MnCP-Ru：ROS与相应生物催化剂（50 μg mL⁻¹）共处理。数据以平均值±SD表示。多组比较采用单因素方差分析，随后进行Tukey事后检验进行两两分析；所有检验均为双侧。星号表示与损伤模型（ROS）组相比的显著性：p <0.05，p <0.01，p <0.001，****p <0.0001。带井号标记的水平括号表示特定组间的显著两两比较：#p <0.05，##p <0.01，###p <0.001，####p <0.0001。

（4）对MCAO/R大鼠脑缺血再灌注损伤的体内神经保护效果

采用大脑中动脉栓塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型验证MnCP-Ru的体内神经保护效果。2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色显示，生理盐水组MCAO/R大鼠出现大面积脑梗死（白色未染色区域），而MnCP-Ru处理显著缩小梗死面积。定量分析显示，生理盐水组梗死面积约26.73%，MnCP-Ru注射后降至3.85%。此外，MnCP-Ru给药显著改善了MCAO/R大鼠的神经功能评分，治疗组大鼠体重增长与正常大鼠相近，而生理盐水组几乎无体重增长。Kaplan-Meier生存曲线显示，生理盐水组45%大鼠在MCAO/R诱导后5天内死亡，而MnCP-Ru处理组所有大鼠存活超过14天。磁共振成像（MRI）检查结果与TTC染色一致。苏木精-伊红（H&E）染色显示，生理盐水组神经元大量丢失、形态不规则、排列紊乱，MnCP-Ru治疗显著减少坏死区域。Nissl染色显示，MnCP-Ru显著恢复缺血脑组织中的Nissl小体密度。

图5. MnCP-Ru对脑缺血再灌注损伤的体内神经保护效果。a) 建立、治疗和评估MCAO/R大鼠模型的实验时间线示意图。b) 脑梗死分析的大脑切片示意图。c) 各实验组TTC染色脑切片，红色表示正常组织，白色表示梗死区域。d) 顺利获得Image J分析的不同组梗死比例（n = 3每组）。e) MCAO/R大鼠的神经功能评分（n = 9每组）。f) MCAO/R大鼠治疗后的体重变化（n = 7每组）。g) 接受不同治疗的MCAO/R大鼠的Kaplan-Meier生存曲线（顺利获得log-rank检验比较）。h) 脑部MRI评估示意图。i) 治疗后2周MCAO/R大鼠T2加权MRI轴位视图。j) 各组脑组织切片的代表性H&E和Nissl染色图像。比例尺，50 μm。数据以平均值±SD表示。统计学显著性采用单因素方差分析 followed by Tukey多重比较检验评估。星号表示与生理盐水组相比的p值：p <0.05，p <0.01，p <0.001，****p <0.0001，ns表示无显著差异。

（5）MnCP-Ru抗脑缺血再灌注损伤的治疗机制研究

进一步探究MnCP-Ru抗缺血性卒中的体内机制。SOD活性检测显示，MCAO/R大鼠脑组织SOD活性较假手术组显著降低，MnCP-Ru给药后显著恢复SOD活性。丙二醛（MDA）水平检测表明，MnCP-Ru治疗显著降低脑组织脂质过氧化终产物MDA含量。神经元特异性核蛋白（NeuN）免疫荧光染色显示，MnCP-Ru处理后NeuN⁺细胞数量较生理盐水组增加1.9倍；末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）染色显示，MnCP-Ru使TUNEL⁺细胞减少3.1倍，表明其有效减轻神经元损伤和凋亡。免疫组化染色显示，MCAO/R模型触发小胶质细胞（离子化钙结合衔接分子1，Iba-1）和星形胶质细胞（胶质纤维酸性蛋白，GFAP）的异常激活，MnCP-Ru处理后Iba-1阳性细胞数量显著减少，GFAP⁺细胞数量亦明显降低。此外，MnCP-Ru显著降低梗死脑组织中促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）的分泌水平。上述结果表明，MnCP-Ru顺利获得抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的异常激活，控制神经炎症反应，从而增强神经保护效果。

图6. MnCP-Ru抗脑缺血再灌注损伤的治疗机制研究。a) 缺血再灌注期间氧化应激诱导神经元凋亡的示意图。b) 不同治疗组脑组织中SOD的表达水平（n = 6每组）。c) 不同治疗组脑组织中MDA含量（n = 6每组）。d) MCAO/R大鼠脑切片的NeuN（绿色）及4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）共染。比例尺，100 μm（上图）和50 μm（下图）。e) MCAO/R大鼠脑切片的TUNEL（绿色）及DAPI（蓝色）共染。比例尺，50 μm。f) 图6e的半定量分析（n = 5每组）。g) 图6d的半定量分析（n = 5每组）。h) 不同处理组大鼠脑组织中GFAP、Iba-1和IL-1β的代表性免疫组化染色图像。比例尺，GFAP/DAPI为20 μm，Iba-1/DAPI为50 μm，IL-1β/DAPI为20 μm。i–k) 各标志物对应的半定量分析。i) GFAP⁺细胞数量。j) Iba-1⁺细胞数量。k) IL-1β的平均光密度（AOD）。l) MnCP-Ru抑制胶质细胞激活和炎症反应的示意图。数据以平均值±SD表示。统计学显著性采用单因素方差分析 followed by Tukey多重比较检验评估。星号表示与生理盐水组相比的p值：p <0.05，p <0.01，p <0.001，****p <0.0001，ns表示无显著差异。