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针对上述问题，山东大学齐鲁医院程雷教授联合材料科学与工程学院张忠华教授设计并制备了类似生态位的多尺度多孔钛（p-Ti）植入物，用于原位调节骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的再生修复潜力，同时缓解骨骼重建过程中的免疫衰老。以商业Ti为基准，兔子和大鼠的体外和体内结果表明，生态位状的p-Ti能够高效促进BMMSC，形成骨生成表型并调谐骨缺损区域。此外，类生态位的多尺度多孔结构与骨-植入界面的BMMSC骨发生分化，生成焕发的ARG1巨噬细胞，调节免疫衰老，协同促进骨整合。该文章于2026年3月28日以《Three-dimensional niche-like porous structure locoregionally regulating macrophage immunosenescence rejuvenates aged bone repair》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI:10.1016/j.bioactmat.2026.03.028）。

方案1. 类生态位多孔钛（p-Ti）实验设计流程图

（1）巨噬细胞中ARG1表达下调与衰老阶段相关

为评估巨噬细胞在衰老中的功能恢复，利用年轻（2月龄，n=4）与老年（22月龄，n=2）小鼠的scRNA-seq数据（图1a）。UMAP聚类识别出13种细胞类型，包括内皮细胞、T细胞、B细胞、单核来源巨噬细胞等（图1b）。细胞间通讯分析显示密集的配体-受体网络（图1c），单核来源巨噬细胞呈现年龄依赖性的胶原信号变化（图1d）。衰老过程中，亚群划分为ARG1、CFP、IL1β、CD74、LYVE1巨噬细胞及中性粒细胞（图1e-f）。ARG1比例逐渐下降（图1g-h）。泛巨噬细胞标志物CD68和IRF5广泛表达，而M2相关基因CD163仅限于LYVE1巨噬细胞（图1i）。将ARG1巨噬细胞定位为前体样细胞，IL1β为终末分化状态（图1j-l），炎症介质（CCL9、IL6、IL1α、IL1β）沿分化轴逐步上调。免疫荧光证实年轻巨噬细胞表达较高ARG1（图1m）。

图1. ARG1基因在衰老巨噬细胞中的关键作用。（a）示意图展示了单细胞测序和免疫荧光染色揭示的衰老小鼠中ARG1的差异表达。（b）描绘免疫细胞的单细胞UMAP图概览。（c）不同免疫细胞之间相互作用数量的差异。（d）年轻与衰老物种中单核巨噬细胞的信号传导变化。（e） 展示单核巨噬细胞的单细胞UMAP图概览。（f）展示单核巨噬细胞六种亚型中特异性标志物的基因热图。（g）六种亚型在不同物种中的分布。（h）六种亚型在年轻组和衰老组中的分布。（i） UMAP图上各细胞聚类中经过整理的特征基因的平均表达水平。（j）展示单核细胞衍生巨噬细胞分化随时间动态变化的基因热图。（k）利用Monocle 2算法预测细胞分化状态，用于单细胞分化的时序分析。（l）基于Monocle建模的ARG1+、LYVE1+、巨噬细胞、CD74+、巨噬细胞、IL1β+巨噬细胞及巨噬细胞的分布图。（m）不同衰老阶段巨噬细胞ARG1蛋白的免疫荧光染色。

（2）p-Ti圆盘的制备与表征

VPA阶段，Ti与Zn蒸气在低压高温下反应生成锌钛合金，EDS显示Ti与Zn在II区（厚149.27 μm）发生扩散合金化，XRD证实新相TiZn3生成（图2a-d）。VPD后，选择性去除Zn原子使TiZn3相消失，并形成两类孔隙：宽约100 μm的长沟和主孔径3.4 μm的空腔，其间分布大量孔径0.5 μm的凹槽（图2e-f），使比表面积达2.36 m²/g。元素分析显示残留Zn约1.6%，并诱导少量β-Ti相出现（图2g-h）。电化学测试表明p-Ti腐蚀电位较正（-0.142 V），腐蚀电流略大（5.018×10^-6 A），13天累积Zn²⁺释放量为0.31 mg/L，低于促骨浓度范围，生物效应非主要因素（图2i-j）。

图2.Ti和p-Ti植入体的表征。（a） p-Ti制备过程的示意图。（b） VPA处理后Ti/合金Ti界面的横截面形态及（c）相应的元素分布。（d）（b）中区域I和II的XRD图谱。（e） p-Ti的表面形态及（f）其黄色区域的放大形态。（g） Ti和p-Ti圆盘的元素含量、（h） XRD图谱以及（i）塔菲尔图。（j） Zn²⁺圆盘随时间变化的释放曲线。

（3）体外生态位样p-Ti细胞重塑特性及细胞毒性评估

p-Ti的多尺度多孔结构可重塑细胞伪足扩散与变形，增强细胞附着力，进而有效调控成骨细胞分化与骨整合（图3a）。研究顺利获得SEM、Phalloidin/DAPI染色观察细胞形态与骨架，并采用7-AAD/Annexin V、活/死染色及MTT法系统评估细胞毒性（图3b）。结果表明，BMMSCs在p-Ti支架上充分铺展并形成大量短小伪足，而裸Ti表面细胞则呈近似球形（图3c、d）。流式细胞术显示p-Ti组活细胞比例（73.98%）与Ti组（73.01%）相比无显著差异（图3e），活/死IF染色结果与之相符，证实p-Ti未诱导BMMSCs凋亡（图3f、g）。

图3. P-Ti盘具有良好的细胞相容性。（a）示意图展示了仿生多尺度微环境样结构，该结构可引导细胞伪足像章鱼触手般穿透P-Ti，增强细胞附着，从而改善骨整合性能。（b）实验时间表示意图。（c）植入物上大鼠骨髓间充质干细胞（BMMSCs）的扫描电子显微镜（SEM）形态图，以及（d）第1天的免疫荧光（IF）染色图。（e）采用7-AAD/Annexin V染色法测定植入物上大鼠BMMSCs的凋亡率。（f）大鼠BMMSCs的活/死染色图像。（g）活/死染色图像的定量分析。

（4）大鼠BMMSCs在p-Ti支架上的骨生成分化

顺利获得RT-PCR、免疫荧光（IF）、Western blot及Alizarin红染色等多方法评估p-Ti支架诱导BMMSCs成骨分化的能力（图4a）。RT-PCR显示，与裸Ti相比，p-Ti组ALP、OCN、RUNX2和COL1的mRNA水平均显著升高，其中OCN表达增加近四倍（图4b-e）。IF染色与Western blot进一步证实p-Ti组ALP和OCN蛋白表达显著上调（图4f-i）。Alizarin红染色表明p-Ti促进更多成骨相关钙结节形成（图4j、k）。机制上，p-Ti的生态位状多孔结构促进细胞伪足延伸并嵌入孔隙，使细胞紧密贴附于支架表面，可能激活局灶粘附激酶并调控下游信号通路，从而有效促进BMMSCs的骨生成与分化。

图4. P-Ti圆盘对大鼠骨髓间充质干细胞成骨作用的影响。（a）实验流程示意图。（b-e）大鼠骨髓间充质干细胞在植入物上培养第2天的ALP （b）、OCN （c）、RUNX2 （d）和COL1 （e）表达情况。（f）顺利获得免疫荧光染色对植入物上大鼠骨髓间充质干细胞第3天ALP表达的定量分析。（g）顺利获得免疫荧光染色观察植入物上大鼠骨髓间充质干细胞第3天ALP的表达。（h）顺利获得免疫荧光染色对植入物上大鼠骨髓间充质干细胞第7天OCN表达的定量分析。（i）顺利获得免疫荧光染色观察植入物上大鼠骨髓间充质干细胞第7天OCN的表达。（j）植入物上培养的大鼠骨髓间充质干细胞的茜素红染色图像。（k）茜素红染色的定量分析。

（5）大鼠巨噬细胞p-Ti的免疫衰老调节

巨噬细胞在p-Ti与Ti表面培养2天后，p-Ti组CD206表达显著增加，ARG1和BMP2表达升高，M1/M2比值最低，表明其倾向诱导M2极化（图5a-f）。IF染色显示CD206阳性细胞增多（图5g），ELISA证实M2相关细胞因子分泌增加（图5h、i）。p-Ti的多尺度孔隙结构不仅促进ARG1巨噬细胞产生，显著减弱免疫衰老标志物p16和p21的表达（图5j、k）。条件培养基实验表明，p-Ti诱导的巨噬细胞微环境可上调BMMSCs早期（ALP）和晚期（OCN）成骨标志物（图5l-n）。转录分析显示ARG1巨噬细胞中精氨酸/脯氨酸代谢及VEGF信号上调，炎症与细胞衰老通路下调（图5o）。

图5.P-Ti调节巨噬细胞免疫衰老和炎性细胞因子的分泌。（a）评估P-Ti体外骨免疫调节作用的流程图。（b）采用RT-PCR检测在P-Ti上培养的巨噬细胞中iNOS、CD206 （c）、ARG1 （d） 和BMP2 （e）的表达。（f）定量分析及代表性图像。（g）针对p-Ti上巨噬细胞表面标志物（iNOS和CD206）的免疫荧光染色。（h）顺利获得ELISA测定在p-Ti上培养第2天巨噬细胞产生的IL-10和IL-6 （i）。（j）顺利获得Western blot （k）和定量分析测定条件培养基系统中巨噬细胞的CD163、IL1β、p16和p21表达。（l）顺利获得免疫荧光染色和定量分析测定条件培养基系统中大鼠骨髓间充质干细胞的ALP （m）和OCN （n） 表达。（o）显示ARG1+巨噬细胞标志基因富集GO术语的网络图。

（6）p-Ti支架的体内骨整合

在大鼠股骨缺损模型中植入Ti和p-Ti棒，术后4周和6周分别注射钙黄绿素和茜素红，8周行显微CT及H&E、Goldner染色分析（图6a）。结果显示，两组股骨长度相近，表明p-Ti不影响骨骼正常生长（图6b-d）。激光共聚焦显示p-Ti组早期和晚期骨生成均显著优于Ti组（图6c、6e）。器官比较分析证实植入物未影响实体器官生理状态，具有良好的体内生物相容性（图6f）。机制上，p-Ti的多尺度多孔结构可激活BMMSCs，其丝状伪足作为"触角突触"感知细胞外基质形态刺激并转导生化信号，进而调控基因表达促进全链成骨。

图6. P-Ti植入物可促进骨缺损模型中的骨整合。（a）P-Ti植入物体内成骨效应评估流程图。（b）取出的大腿骨照片。（c）经钙黄绿/茜素红染色的硬组织切片图像。（d）植入后8周不同组大腿骨长度的定量分析。(e)经钙黄绿素染色的硬组织切片定量分析。（f）不同处理组大鼠器官的代表性H&E染色图像。

（7）体内成骨的形态学和X线学分析

组织学与Goldner染色显示，4周和8周时p-Ti组新骨形成均显著高于Ti组（图7a-f）。micro-CT分析表明p-Ti组BV/TV提高约50%，Tb.N和Tb.Th增加而Tb.Sp降低，三维重建显示其周围形成均匀致密的新骨层（图7g-k）。机制上，转录组分析显示p-Ti上调MSX2、DLX3、RUNX2、SPP1等成骨基因及矿物质吸收、PI3K-Akt通路，下调TWIST1/2、IL1α、IL6、TNFα和IL17等炎症因子与基质降解酶（图7l）。配体-受体分析揭示ARG1巨噬细胞与年轻成骨细胞、内皮细胞等存在强相互作用（图7m）。单细胞轨迹分析显示ARG1巨噬细胞在年轻组织中富集并与巨噬细胞年轻化相关，而IL1β、LYVE1和CD74巨噬细胞则呈现衰老相关激活模式（图7n-q）。

图7. p-Ti植入物在骨缺损模型中诱导骨整合的机制。（a）4周时经H&E和Ladewig染色的硬组织切片图像及定量分析（b、c）。（d）8周时经H&E和Ladewig染色的硬组织切片图像及定量分析（e、f）。BV/TV% (g)、Tb.N (h)、Tb.Sp (i)及Tb.Th (j)的定量分析。(k)微CT的冠状面、矢状面、3D及新骨图像。(l)选定基因表达倍数变化的热图。(m)显示ARG1+巨噬细胞与其他细胞之间细胞-细胞相互作用的网络图。环形图的大小代表细胞-细胞相互作用的频率。线的粗细代表相互作用的强度。(n)显示ARG1+巨噬细胞（p）、CD74+巨噬细胞、IL1β+巨噬细胞（o）及LYVE1+巨噬细胞（q）亚群在不同时间点年轻与衰老巨噬细胞中的百分比。

（8）p-Ti群免疫调节的机制

对p-Ti和Ti组细胞进行RNA测序以探讨其调控骨免疫微环境的分子机制（图8a）。火山图和热图显示p-Ti组有1283个基因上调、1469个基因下调（图8b-d）。GSEA分析发现p-Ti组IL17信号通路相关基因显著下调（图8c）。GO富集分析表明，p-Ti组中细胞表面、细胞外基质、氧化还原酶活性及炎症反应相关基因显著富集，且由IL17信号通路驱动（图8e）。基因集富集分析进一步识别出IL17通路为关键调控信号（图8f），该通路中TRAF4将EGFR与IL17R复合体结合并激活下游ERK5级联反应。表明p-Ti顺利获得抑制IL17-TRAF4-ERK5信号通路发挥抗炎及促骨免疫微环境调控作用。

图8 .p-Ti介导的骨免疫调节分子机制。（a） p-Ti顺利获得IL17/TRAF4/ERK5轴介导骨髓间充质干细胞（BMMSC）免疫调节的机制。（b） p-Ti或Ti处理后差异表达基因的火山图。（c）基于GSEA的IL17信号传导通路。（d）显著差异表达基因的倍比变化热图。（e） p-Ti或Ti处理后差异表达基因的GO分析。（f）与IL17信号传导通路相关的差异表达基因。

（9）p-Ti在衰老模型中的治疗效果评估

Ti或p-Ti螺钉植入老年兔子中，以评估p-Ti在衰老模型中的治疗效果，并准备用于临床前使用（图9a）。植入后8周进行的显微CT分析显示p-Ti组股骨缺损部位骨骼再生显著增强，表现为与传统Ti对照相比，BMD、BV/TV增加及Tb.Sp下降（见图9b-e）。这些发现证明了p-Ti促进老年患者骨质生成的能力，给予了其在衰老微环境中免疫调节作用的机制证据，并支持其在与年龄相关的骨骼修复临床应用中的转化潜力。

图9.具有轮廓化微环境样结构的p-Ti植入物的应用场景与特性分析。（a）顺利获得p-Ti植入物评估兔体内成骨效应的流程图。（b）微CT重建图像的X、Y和Z轴示意图。骨密度（BMD）的定量分析（c）骨体积/总体积比（BV/TV%）（d）及骨小梁面积（Tb.Sp）（e）。（f）微CT的横断面、冠状面、新骨与螺钉及新骨图像，橙色区域被选定为感兴趣区域（ROI）。（g-i）用于人类的异形生态位样p-Ti植入物的示意图。插图展示了适用于钛网笼（g）、椎弓根螺钉固定（h）及扩张性椎板成形术（i）的巢状p-Ti植入物的数字图像。（j）用于扩张性椎板成形术的轮廓化植入物插图中绿色区域的形态。（k） （j）中红色区域的放大形态。（l，m） （k）中黄色区域（l）和蓝色区域（m）多孔结构的形态。