球盟会(中国)

图2. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的表征。A) 不同GA与PTD-sp质量比的GA-siTNFα-PS的siRNA负载效率，B) Zeta电位，C) 粒径。D) GA-siTNFα-PS的TEM图像。E) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel自固化过程。F) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的流变学性质。G) 不同DA-OIn浓度的GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的凝胶时间。H) GA-siTNFα-PS在SHE-Gel中的包封效率（n = 3）。I) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的可注射性。J) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在小鼠胃中的自固化过程。K) 自愈合能力示意图。L) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的机制。M) 不同DA-OIn浓度的GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗压强度。N) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（用蓝墨水染色）对小鼠结肠的强效粘附。O-P) 不同DA-OIn浓度和GA-siTNFα-PS浓度下GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在猪皮上的粘附强度

（2）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化和抗炎能力

研究了包封Cy5标记的siTNFα（Cy5-siTNFα）的GA-siTNFα-PS的细胞摄取情况，游离siRNA很难进入细胞，而聚合物囊泡可以将siRNA递送到细胞内（图3A）。使用LPS刺激的巨噬细胞（LPS组）研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化能力，该组显示出最强烈的ROS荧光（45.8%）（图3B和C），GA-siTNFα-PS/SHE-Gel显示出优异的ROS清除效果，这源于水凝胶表面的多巴胺和巯基以及GA-siTNFα-PS中的没食子酸的协同抗氧化作用。顺利获得评估M1巨噬细胞相关因子TNF-α、IL-6和M2巨噬细胞相关因子IL-10的细胞因子表达，进一步评估了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗炎能力（图3D-F）。与水凝胶SHE-Gel和SO-Gel相比，该水凝胶表现出最高的TNF-α和IL-6抑制能力，这归因于水凝胶中DA-OIn和SH-SA的抗氧化能力，以及GA-siTNFα-PS给予的ROS清除活性和TNF-α沉默能力的协同效应。同时，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel显著上调了M2相关的IL-10，表明它顺利获得抑制M1巨噬细胞极化和促进M2巨噬细胞活化从而发挥了优异的抗炎作用。

图3. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的抗氧化和抗炎能力。A) LPS刺激的RAW264.7细胞与Cy5-siTNFα、Cy5-siTNFα-PS、GA-Cy5-siTNFα-PS孵育4小时或8小时后的CLSM图像。比例尺，25 µm。B) 细胞内ROS染色图像。C) 不同处理后DCFH标记的RAW264.7细胞的流式细胞术分析，比例尺，200 µm。D-F) 细胞外TNF-α、IL-6和IL-10表达的ELISA结果（n = 3）

（3）胃肠道稳定性和结肠响应性降解

在模拟结肠液（SCF）或含有微生物特异性菊粉酶的SCF中研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的微生物响应性降解能力和药物释放。SEM显示，水凝胶在SCF中孵育4或12小时后发生溶胀且孔径增大（图4A），探索了GA-siTNFα-PS的体内递送效率，DSS + Cy5-PS组由于Cy5-PS的胃肠道不稳定性，腹部荧光持续时间短。与DSS + Cy5-PS/SO-Gel组相比，DSS + Cy5-PS/SHE-Gel组小鼠腹部的荧光强度在24小时内保持高水平（图4B-E），表明GA-siTNFα-PS/SHE-Gel具有胃肠道稳定性，并由于DA-OIn网络中的儿茶酚结构而延长了肠道滞留时间。Cy5-PS在UC小鼠结肠中显示出比健康小鼠结肠更强的荧光强度（图4F和G），即发炎结肠区域积聚丰富的带正电蛋白质，带负电的纳米颗粒可以顺利获得静电相互作用归巢到该区域。这些结果表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel经历胃收缩、肠道逐渐溶胀以及在结肠中菊粉酶响应性释放GA-siTNFα-PS，最终实现GA-siTNFα-PS对发炎结肠部位的静电靶向。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在胃中自固化、在肠道滞留并在结肠微生物响应性降解的机制, 其中释放的GA-siTNFα-PS可顺利获得静电相互作用富集在发炎结肠（图4H）。

图4. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel抵抗胃液，延长肠道滞留时间，并最终以微生物组响应方式在结肠降解。A) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在不同模拟液中孵育不同时间后的SEM图像。B) UC小鼠或健康小鼠在不同时间点的体内成像以及C) 灌胃Cy5标记的GA-siTNFα-PS（Cy5-PS）、Cy5-PS/SO-Gel或Cy5-PS/SHE-Gel 24小时后UC或健康小鼠结肠的离体图像，以及它们对应的D) 小鼠体内成像和E) 结肠离体图像的荧光半定量分析（n = 3）。F) UC或健康小鼠结肠与Cy5-PS培养1小时并用PBS洗涤（3次）后的体外图像和G) 荧光半定量分析（n = 3）。H) GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在胃中自固化、在肠道滞留并在结肠微生物响应性降解的机制，其中释放的GA-siTNFα-PS可顺利获得静电相互作用富集在发炎结肠

（4）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在UC小鼠模型中的良好治疗效果

顺利获得让小鼠饮用DSS溶液（3%，w/v）7天建立DSS诱导的结肠炎小鼠模型。在第二天口服给予各种水凝胶（图5A）。结果表明，口服SHE-Gel（G1）、GA-PS/SHE-Gel（G2）、siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）和GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）后，结肠炎小鼠的炎症进展得到抑制，证据包括降低的疾病活动指数（DAI）（图5B）、体重减轻抑制（图5C）和结肠长度恢复（图5D和E）。H&E染色结果显示，与siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）、GA-PS/SHE-Gel（G2）和SHE-Gel组（G1）相比，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）治疗更有效地抑制了DSS诱导的结肠组织损伤，表现为隐窝结构破坏减轻、杯状细胞数量恢复和炎症细胞浸润减轻（图5F）。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel的强大炎症抑制效果可能归因于GA-siTNFα-PS中的GA清除了细胞内ROS，顺利获得保护siTNFα完整性提高了TNFα沉默效率，此外还有SHE-Gel的抗氧化能力。这表明GA-siTNFα-PS/SHE-Gel可以有效阻断DSS诱导的结肠炎症过程并维持肠道屏障功能。同时，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel组结肠促炎细胞因子（TNFα和IL-6）的mRNA水平被有效抑制（图5G和H），而与PBS组相比，抗炎因子IL-10和组织修复相关细胞因子转化生长因子-β（TGF-β）的mRNA水平升高（图5I和J）。此外，分析了结肠中的巨噬细胞类型（图5K），经GA-siTNFα-PS/SHE-Gel治疗后，M1巨噬细胞含量显著减少，M2巨噬细胞含量显著增加。同时，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel治疗显著减弱了DSS诱导的炎症结肠组织中髓过氧化物酶（MPO）的阳性表达（图5L）。这些发现表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel有效调节炎症反应，减少氧化应激，并促进M1向M2巨噬细胞转化，从而治疗DSS诱导的结肠炎。

图5. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel在DSS诱导的UC小鼠模型中的治疗性能。A) 实验设计。给小鼠给予3% DSS无菌水7天。从第二天开始口服给药，第八天处死小鼠。B)和 C) DAI评分和体重（n = 6）。D)和 E) 结肠长度测定（n = 6）。F) 结肠组织的代表性H&E染色图像。G-J) 结肠TNFα、IL-6、IL-10和TGF-β的mRNA水平（n = 3）。K) 结肠组织中M1巨噬细胞（CD80（红色）和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色））和M2巨噬细胞（CD163（绿色）和DAPI（蓝色））的免疫荧光分析。L) 结肠组织中MPO的免疫组织化学染色。(比例尺，200 μm)

（5）GA-siTNFα-PS/SHE-Gel对UC小鼠肠道微生物群的调控作用

肠道微生物群的失调与小鼠DSS诱导结肠炎的开展密切相关。顺利获得16S核糖体RNA基因V3-V4区测序检测了肠道微生物组的变化。根据操作分类单元（OTU）的chao、simpson和shannon指数，经PBS或水凝胶处理后，肠道微生物组的丰富度和多样性没有差异（图6A–C）。这可能是因为结肠炎的持续时间较短。主坐标分析（PCA）显示，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）显著改变了DSS诱导结肠炎小鼠的微生物群落组成（图6D），并且与对照组相似。siTNFα-PS/SHE-Gel组（G3）和GA-PS/SHE-Gel组（G2）接近G4，而SHE-Gel组（G1）显示出远离DSS组并更接近G3和G2的趋势。

属水平（图6E）和科水平（图6F）的一般肠杆菌组成分别顺利获得柱状图和热图显示。口服SHE-Gel（G1）、GA-PS/SHE-Gel（G2）、siTNFα-PS/SHE-Gel（G3）和GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（G4）后，属水平的微生物组组成得到改善。特别是，G4显示出显著增加的有益菌_norank-f-Muribaculaceae、Turicibacter和Lactobacillus_的丰度，以及减少的_Escherichia-Shigella_（一种引起肠道感染并加重肠炎的有害病原体）的相对丰度。接下来，在科水平上定量分析了几种特殊细菌（图6G–J）。GA-siTNFα-PS/SHE-Gel处理显著保留了Muribaculaceae（维持健康肠道稳态的主要肠道微生物群）、Lactobacillaceae（促进肠道平衡并增强宿主免疫力）和_Bifidobacteriaceae_（改善由免疫系统紊乱引起的溃疡性结肠炎）的相对丰度。而Enterobacteriaceae（一类常见的人畜共患病原体或主要人类病原体）则显著减少。这些结果表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel顺利获得有效促进有益菌生长和减少有害菌，持续调节肠道微生物群。此外，顺利获得测量治疗7天后小鼠血清中TNF-α、IL-6和TGF-β的水平，评估了水凝胶对DSS诱导的全身性炎症的影响。结果显示，给予DSS 7天后，TNF-α和IL-6升高。经SHE-Gel（G1）治疗后，它们的水平降低，这归因于SH-SA的流体抗炎作用与DA-OIn的ROS清除和菌群调节的协同效应（图6K–M）。

图6. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel调节的肠道微生物群分析。 A) Chao, B) Simpson, 和 C) shannon指数，显示观察到的操作分类单元（OTU）的α多样性（n = 6）。D) 主坐标分析显示肠道微生物组的β多样性（n = 6）。E) 属水平的群落柱状图（n = 5）。F) 科水平的群落热图分析（n = 5）。从F中收集的G) Muribaculaceae, H) Lactobacillaceae, I) Bifidobacteriaceae, 和 J) Enterobacteriaceae的相对丰度（n = 5）。K–M) 血清TNFα、IL-6和TGF-β浓度（n = 3）

（6）GA-siTNFα-PS/ SHE-Gel联合抗TNFα抗体治疗晚期结肠炎模型的有效性

研究了GA-siTNFα-PS/SHE-Gel（Gel）、英夫利昔单抗（iv）和Gel + 英夫利昔单抗（iv）在顺利获得自由饮用3% DSS无菌水七天建立的晚期结肠炎中的治疗效果，治疗从第八天开始（图7A）。Gel给药抑制了晚期UC小鼠的体重减轻（图7B），恢复了缩短的结肠长度（图7C和D）并减少了脾脏重量。Gel治疗与英夫利昔单抗（iv）具有相似的治疗效果，这可能归因于在siTNFα转染之前，DA-OIn中的DA和GA-siTNFα-PS中的GA具有快速的ROS清除能力。Gel + 英夫利昔单抗治疗有效缓解了晚期UC小鼠的症状，所有指标均接近正常小鼠（对照组）。H&E染色结果显示，Gel + 英夫利昔单抗保留了结肠组织完整性，并维持了与对照组相似的杯状细胞数量（图7E）。此外，Gel + 英夫利昔单抗治疗后ZO-1的表达显著增加（图7F）。这些发现表明，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel加英夫利昔单抗可以有效改善晚期结肠炎模型中的炎症微环境并恢复肠上皮屏障功能。

探索了Gel + 英夫利昔单抗的治疗机制。Gel + 英夫利昔单抗组结肠M1相关促炎细胞因子TNFα和IL-6的mRNA水平被有效抑制，而M2相关IL-10和TGF-β的表达增加（图S31，支持信息），接近对照组。此外，与PBS组相比，Gel + 英夫利昔单抗显著降低了结肠组织中MPO的阳性表达（图7G）。这些结果表明，Gel + 英夫利昔单抗可以顺利获得抑制氧化应激和促进M1向M2转化来有效治疗晚期UC小鼠。球盟会(中国)根据OTU的chao、ace和sobs指数，Gel + 英夫利昔单抗治疗增加了肠道微生物组的丰富度和多样性（图7H–K），尽管shannon指数没有显著差异。PCA显示，Gel + 英夫利昔单抗治疗显著改变了晚期结肠炎小鼠的微生物群落组成。Gel + 英夫利昔单抗组属水平的微生物组组成显著改善，并保持了与对照组相似的组成。接下来，在科水平上定量分析了几种特殊细菌（图7L–O）。Gel + 英夫利昔单抗治疗显著保留了有益菌Muribaculaceae、_Akkermansiaceae和Erysipelotrichaceae_的相对丰度。而有害菌_Enterococcaceae_则显著减少。这些结果表明，在晚期结肠炎模型中，GA-siTNFα-PS/SHE-Gel联合英夫利昔单抗顺利获得增加有益菌丰度和减少有害菌持续调节了肠道微生物群。

图7. GA-siTNFα-PS/SHE-Gel加英夫利昔单抗在晚期结肠炎模型中的治疗性能。A) 实验设计。给小鼠给予含有3% DSS的无菌水7天。治疗从第8天开始，陆续在进行7天。所有小鼠在第15天处死。B) 记录每日体重变化（n = 5）。C) D) 测量和分析结肠长度（n = 5）。E) 各组结肠组织的代表性H&E染色图像。F) ZO-1的免疫荧光分析。G) 结肠组织中MPO的免疫组织化学染色。H) Chao, I) ace, J) sobs, 和 K) 观察到的OTU的shannon指数（n = 5）。从科水平群落热图分析收集的L) Muribaculaceae, M) Akkermansiaceae, N) Erysipelotrichaceae, 和O) Enterobacteriaceae的相对丰度（n = 5）。(比例尺，200 µm)