球盟会(中国)

图1. BGCN的特征。a)BGCN的X射线衍射图；b)Mn 2p的XPS谱；c)O 1S的XPS谱；d)BGCN的TEM电子显微镜图像；e)BGCN的高分辨率电子显微镜图像；f)BGCN的透射电子显微镜元素图谱；g)BGCN的FTIR光谱；h)BGCN的氮吸附/脱附等温线；i)BGCN的孔径分布

（2）纳米酶及其体外抗菌活性

超氧化物歧化酶顺利获得清除超氧阴离子自由基，具有促进伤口修复的能力。图2a~c显示BGCN对O2·−具有较强的清除能力，当浓度为1 mg/mL时，其清除率可达60%以上，这是单个二氧化硅纳米粒子所不具备的性能。图2d~f表明BGCN 能分解 H₂O₂ 并产生大量 O₂，表现出类似在人体内，过氧化氢的清除主要依赖于过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)。顺利获得监测过氧化氢酶分解过氧化氢的产物O2(图2d)的产生证明了BGCN具有类似CAT的酶活性。图2e显示1 mg/mL BGCN的氧浓度在90 s内可超过10 mg/mL。除了超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活性外，还研究了BGCN清除羟基自由基(·OH)/DPPh·/ABTS+的抗氧化能力(图2f-l)。当甲基紫(MB)与Fe2+/H2O2混合时，MB的吸收峰几乎消失，这是由于MB被氧化成无色产物。如图2f所示，PBS和SiO2基团没有清除·OH，而在BGCN组中，MB的吸收强度随着样品浓度的增加而同步增加，这表明BGCN随着浓度的变化而逐渐清除·OH。这些结果表明 BGCN 尤其是 BGCN@PDA 在缓解氧化应激、抗菌及促进伤口愈合方面具有巨大潜力。

图2.类酶活性和抗氧化能力的评估。a）BGCN的超氧化物歧化酶活性机理图；b)不同浓度的BGCN清除·O^2-的UV-Vis光谱；c)BGCN的·O2-清除率；d)BGCN的CAT活性机理图；e)在1 mM H₂O₂存在下，不同浓度的BGCN产生O₂浓度；f)BGCN对·OH的清除能力；g)BGCN@PDA的DPPH·清除机理图；h)不同浓度BGCN@PDA清除DPPH·的UV-Vis光谱；i) BGCN@PDA的DPPH·清除；j)BGCN@PDA的ABTS⁺清除机理图；k)不同浓度的BGCN@PDA对ABTS⁺清除作用的UV-Vis光谱；l)BGCN@PDA的ABTS+清除率

（3）光热抗菌性能

考虑到聚多巴胺具有优异的光热性能，该研究测试了BGCN@PDA在808 nm(1.0W·cm⁻²，10min)激光照射下的光热转换性能，如图3a所示,在整个激光照射过程中，SiO2和BGCN的温度没有变化，但BGCN@PDA的温度随着照射时间的增加而升高到50℃以上，其最高温度随着BGCN@PDA浓度的增加而增加(图3b)。随后，该研究选择了0.5 mg/mL的浓度来测试BGCN@PDA的光热稳定性。这对BGCN@PDA作为光热抗菌剂的应用至关重要。图3c五次光热循环实验进一步证实了BGCN@PDA的光热稳定性。这些结果证实了BGCN@PDA具有良好的光热容量和光热稳定性。为了进一步研究BGCN@pda在不同光照条件下的杀菌能力，以SiO₂和BGCN为对照，在1.0w·cm⁻²下进行了抗菌性能测试，结果如图3d-f所示。PBS组和其他组(SiO₂、BGCN、BGCN@PDA)细菌菌落明显，而BGCN@PDA+NIR组细菌数量最多。

图3 BGCN@PDA的光热效应和光热抗菌性能。a)不同样品的光热容量；b)温度曲线c)BGCN@PDA(0.5 mg/mL)的光热循环稳定性。不同标本处理后细菌菌落分布图： d)MRSA、e)金黄色葡萄球菌、f)大肠杆菌；g~i)各组别的抗菌率

（4）BGCN@PDA的细胞相容性、血液相容性和细胞迁移分析

分别使用三种细胞系L929、RAW264.7和HUVECs评估了BGCN和BGCN@PDA的细胞相容性(图4a-c)。与细胞共培养24h后，200 μg/mL BGCN对L92 9和人脐静脉内皮细胞的活力无明显影响，但对RAW2 6 4.7细胞有轻微的细胞毒作用。相反，浓度为20 0 μg/mL BGCN@PDA不仅对三种细胞无毒，而且具有一定的促增殖作用，提示对BGCN进行表面修饰是非常必要的。用红细胞研究了BGCN和BGCN@PDA的血液相容性(图4d)结果表明，PBS组、SiO2组、BGCN组和BGCN@PDA组红细胞无色透明，而阴性对照Triton X100组红细胞破裂。值得注意的是，高浓度(200 μg/mL)的BGCN(溶血和GT；5%)超出了安全范围。BGCN@PDA在浓度为200μg/mL时不存在上述问题，说明PDA不仅提高了BGCN的细胞相容性，而且对BGCN的血液相容性也有很大的贡献。成纤维细胞是结缔组织中最重要的细胞，其增殖和迁移为创面的填充和表皮细胞的覆盖创造了条件。利用L929进行了划痕实验，以探索BGCN@PDA是否具有促进细胞迁移的特性。如图4e示，共培养24 ，各组之间没有差异。48h后，Ctrl组、SiO2组、BGCN组和BGCN@PDA组的迁移率分别为53.69%、55.19%、78.46%和75.72%。此时，BGCN@PDA和Ctrl组之间已经有了显著的差异。结果提示，BGCN@PDA能显著促进L929细胞的迁移，并在创面修复的增殖期发挥持续作用。

图4 BGCN@PDA的细胞相容性和细胞迁移。a -c)BGCN@PDA对人脐静脉内皮细胞(a)、L929细胞(cb)、RAW264.7细胞(c的细胞相容性；d)不同样本的血液相容性；e)L929细胞在不同时间段的划痕代表性图像

（5）抗炎和巨噬细胞表型转化

在伤口修复中，过度的炎症不仅使伤口难以愈合，还会导致各种恶性疾病的并发症。使用内毒素刺激的巨噬细胞来研究BGCN@PDA在基因水平上对促炎因子表达的影响(图5a~b)。与对照组相比，内毒素治疗组大鼠肺组织中IL-6和TNF-α的表达增加。经BGCN@PDA共同孵育后，IL-6和肿瘤坏死因子-α的表达显著降低。此外，二氧化硅还具有抗炎活性，这是顺利获得偏硅酸盐离子(SiO₂^-)的增溶实现的。这些结果表明，BGCN@PDA有望促进伤口从炎症阶段向下一阶段的过渡。为了进一步探讨该物质在免疫调节中的抗炎机制，检测了巨噬细胞的表型转化。巨噬细胞根据周围微环境的不同表现出不同的功能表型(M1/M2)。其中，M1巨噬细胞与促进炎症反应有关，而M2巨噬细胞与免疫调节和减轻炎症密切相关。因此，利用脂多糖诱导M1巨噬细胞活化后，对M1巨噬细胞特征标记的CD86进行流式细胞术分析(图5c)。结果表明BGCN组M1表型巨噬细胞数(55.97%)较内毒素组(62.88%)有所减少，但BGCN+PDA组减少更为明显(53.21%)。免疫荧光染色观察BGCN@PDA对巨噬细胞重编程的影响。结果显示，内毒素组巨噬细胞呈大量高强度红色荧光，CD86阳性细胞数较多，提示内毒素组巨噬细胞主要呈M1型，而BGCN组和BGCN+PDA组的红色荧光强度明显减弱，表明两组M1型巨噬细胞明显减少。图5d的CD206对M2型巨噬细胞的染色显示，BGCN@PDA组出现更明显的绿色荧光提示本组巨噬细胞主要表现为M2表型。以上结果提示，BGCN@PDA可促进巨噬细胞由M1表型向M2表型转化，从而减少促炎因子的释放，达到减轻炎症的效果。

图5 .巨噬细胞炎症相关基因表达及表型分析。a）IL-6和b)TNF -α在不同处理中的表达；c)不同处理后巨噬细胞表型转化的流式细胞术分析；d)不同处理后巨噬细胞表型的免疫荧光染色

（6）细胞内抗氧化活性和氧的产生

感染伤口中的免疫反应紊乱会导致过量的ROS产生，进一步加剧局部组织损伤，导致持续的慢性炎症。进一步评估了BGCN@PDA在清除细胞内ROS方面的作用（图6a）。在LPS处理后，大量的ROS RAW264.7细胞产生绿色荧光，而BGCN组处理后，ROS含量明显降低，BGCN@PDA组的ROS甚至几乎完全消除，表明BGCN @ PDA具有良好的抑制细胞内ROS的能力，在体内平衡氧化应激和治疗炎症相关疾病方面具有潜在的应用价值。一定量的氧气有助于改善组织代谢，抑制厌氧菌的生长，减轻疼痛。图6b使用[Ru（dpp）3] Cl₂氧指示探针来检测分子氧的产生在将探针与L929细胞共孵育后，与对照组相比，BGCN组和BGCN@PDA的红色荧光显著减少，这是由于动态爆发效应，分子氧的存在使[Ru（dpp）₃]Cl₂的发光强度降低，说明BGCN@PDA具有一定的产氧能力。

图6 胞内ROS的清除和胞内氧气的产生。a)DCFH-DA检测不同样品处理后RAW 264.7细胞中ROS清除的荧光图像；b)[Ru(Dpp)3]Cl2检测不同样品处理后L929细胞中的氧产生图像

（7）MRSA感染伤口治疗

基于BGCN@PDA优异的抗感染和氧化应激调节能力，使用耐药菌感染伤口的小鼠作为模型来研究BGCN@PDA用于组织修复的治疗效果。图7a显示了在特定时间点不同治疗组对MRSA感染伤口修复的影响。在第3天，SiO₂，与对照组相比，BGCN和BGCN@PDA组能够加速伤口闭合，但同时出现大量黄色脓液，这是由于严重的细菌感染。相反，BGCN@PDA + NIR组显著加速了伤口闭合并解决了感染。在第7天，与其他组相比，BGCN和BGCN@PDA组的伤口面积显著减小，并且BGCN@PDA + NIR组的伤口愈合率已经高达76.7%（图7 b~c）。为了进一步考察BGCN@PDA + NIR组在体内治疗过程中的抗感染能力，从各组的创伤伤口中收集细菌，结果如图7e所示，在第3天，对照组、SiO₂组、BGCN组和BGCN@PDA组有大量的细菌菌落，而BGCN@PDA + NIR在光热抗菌作用下能有效防止创面细菌感染，表现出较好的早期抗感染能力，第7天，对照组和SiO₂组的菌落数最高，而BGCN@PDA + NIR组未发现菌落，抑菌率达99%接着，顺利获得苏木精-伊红（H&E）染色评估不同处理对感染伤口的组织学愈合过程的影响。如图7f所示，在第3天，对照组和SiO2组尚未形成表皮层，而BGCN@PDA +近红外组已形成完整的表皮层，随着时间的延长，各组间差异越来越明显，第14天，对照组和SiO₂组的创面仍处于愈合阶段，而BGCN@PDA + NIR组不仅实现了上皮化，皮肤结构基本完整，而且产生了许多毛囊和皮肤附属物，进一步证实了BGCN@PDA对感染皮肤的良好治疗效果。

图7 BGCN@PDA体内感染创面修复与再生。a）感染创面在0、3、7和14天不同处理后修复的代表性图像；b)各组伤口愈合率的定量统计；c) 不同组伤后0~14天创面愈合情况图；d)第3天和第7天的抗感染效果照片；e)第3天和第7天的抗菌率定量统计；f)第3天和第14天各组创面组织的HE染色

为了验证BGCN@PDA对伤口炎症阶段的治疗效果，以促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达水平来评估不同治疗后皮肤组织中的炎症程度（图8a~b）。IL-6和TNF-α的阳性信号在对照组和SiO₂组中表达最清楚，半定量统计结果甚至显示BGCN@PDA + NIR组的炎症信号比对照组减少了40%以上，BGCN和BGCN@PDA的炎症信号也明显减少。新生血管的数量是伤口修复的重要指标，血管内皮生长因子（VEGF）是血管生长的促进剂，在血管生成和伤口愈合中起着重要作用。因此，在第7天顺利获得VEGF免疫组化染色评价样品的血管生成作用（图8 c）BGCN@PDA + NIR组中棕色阳性信号的表达显著高于其他组，提示BGCN@PDA + NIR组具有促进血管生成的作用，这主要是由于炎症期的顺利顺利获得，相反，尽管SiO₂具有良好的促血管生成作用，但现在仍无法发挥其价值，这些结果提示BGCN@PDA作为纳米粉末敷料，比单一的抗菌剂、抗真菌剂或促血管生成剂表现得更好，并且可以在伤口修复的多个阶段发挥不同程度的持续作用。另外，用Masson染色观察在伤口愈合期间胶原纤维的形成情况。图8d中胶原纤维（蓝色）在BGCN@PDA + NIR组中分布最广泛，表明该组中的胶原纤维含量在第14天最丰富。提示BGCN@PDA能有效促进创面修复过程中胶原纤维的形成。

图8 创面组织进行免疫组织化学染色和Masson染色。a)治疗3d后创面的TNF-α染色图像；b)IL-6染色的创面图像；c)治疗7d后创面的血管内皮生长因子染色图像；d)不同处理后第14天的Masson染色分析感染创面在0、3、7和14天不同处理后修复的代表性图像