球盟会(中国)

基于上述发现，中国人民解放军总医院泌尿外科徐俊楠团队提出顺利获得纳米递送系统预先提升肾脏ANXA2水平以预防IRI的策略。研究第一时间利用基因敲除小鼠明确ANXA2在肾脏IRI中的功能角色，证实其顺利获得抑制肾小管坏死性凋亡及下游炎症反应发挥肾脏保护作用。在机制层面，研究关注了坏死性凋亡执行蛋白p-MLKL介导的膜孔形成与ESCRT-III复合物介导的膜修复过程。在此基础上，研究团队构建并表征了负载ANXA2且偶联肾脏靶向肽（KTP）的脂质纳米颗粒（LNP）系统，利用LNP的小尺寸、生物相容性及表面可修饰性，实现ANXA2蛋白向肾小管上皮细胞的高效靶向递送。体内实验证实，该肾脏富集型ANXA2-LNP显著减轻IRI损伤。该研究不仅揭示了ANXA2限制肾脏IRI的新分子机制，更为NSS围手术期预防AKI给予了一种具有临床转化前景的纳米治疗新策略(图1)。相关研究在2026年7月18日以《Kidneyenriched lipid nanoparticles delivering ANXA2 alleviate renal ischemia–reperfusion injury via CHMP2Amediated necroptosis inhibition》为题发表于《Journal of Nanobiotechnology》（DOI: 10.1186/s12951-026-04812-5）。

图1. ANXA2介导ESCRT-III膜修复抑制MLKL依赖性坏死性凋亡及KTP-LNP@ANXA2肾靶向治疗策略。

（1）ANXA2在肾脏IRI后显著上调并发挥肾脏保护作用

该研究团队第一时间观察到，肾脏IRI可诱导ANXA2显著上调。IRI后24小时，损伤标志物Havcr1与Lcn2的mRNA水平显著升高，同时ANXA2在mRNA及蛋白水平均明显上调（图2A和B）。PAS染色及免疫组化结果显示，IRI后ANXA2主要增加并蓄积于髓质肾小管上皮细胞（TEC）的顶膜，尤其以外髓质为著（图2C）。免疫荧光共染色进一步将ANXA2定位于髓袢升支粗段（SLC12A1+）、部分连接小管（AQP2+）及集合管（AQP2+/ATP6V1G3+）的顶膜（图2D）。为探究其功能意义，研究人员对ANXA2敲除（KO）小鼠施加肾脏IRI。结果显示，与野生型对照相比，KO小鼠髓质损伤显著加重，而皮质损伤在两组间无显著差异（图2E和F）；分离髓质组织的分析表明，Anxa2⁻/⁻小鼠中Havcr1和Lcn2表达显著更高（图2G）。AQP1染色显示KO小鼠肾小管管腔塌陷更为严重，提示ANXA2顺利获得抑制TEC死亡减轻IRI早期损伤（图2H）。此外，研究人员发现KO小鼠长期髓质纤维化程度显著加重，而皮质纤维化未见明显差异（图2I和J）。

图2. ANXA2在肾脏IRI后显著上调并发挥肾脏保护作用，肾脏于IRI后24小时取材。（A）检测假手术组与IRI组肾组织中Anxa2、Havcr1和Lcn2的相对mRNA表达水平。（B）检测假手术组与IRI组肾组织中ANXA2的蛋白表达。（C）采用PAS染色和免疫组化染色分析IRI后ANXA2在肾脏中的空间表达模式。（D）在肾脏切片中对ANXA2与肾小管上皮细胞节段特异性标志物进行免疫荧光共染色，包括髓袢升支粗段标志物SLC12A1、集合管标志物AQP2以及闰细胞标志物ATP6V1G3。（E）采用PAS染色评估Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠急性肾损伤的严重程度。（F）使用标准化肾小管损伤评分系统分别对皮质和髓质进行组织病理学损伤评分。（G）特异性分离肾髓质，对Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠进行Havcr1和Lcn2的RT-qPCR分析。（H）进行AQP1的免疫荧光染色，以评估Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠肾小管的结构完整性及肾小管上皮细胞的死亡情况。（I）采用Masson三色染色和α-SMA免疫组化染色评估Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠再灌注28天后的肾纤维化程度。Masson三色染色；α-SMA免疫组化。（J）分别对皮质和髓质进行Masson三色染色评分以量化纤维化程度，并在皮质和髓质各三个预定视野中计数α-SMA阳性细胞后取平均值。

（2）ANXA2顺利获得减少MLKL磷酸化特异性抑制肾小管上皮细胞坏死性凋亡

鉴于ANXA2在髓质中发挥的主要保护作用，研究团队第一时间对髓质组织中的关键细胞死亡通路蛋白进行了分析。结果显示，ANXA2敲除（KO）小鼠中坏死性凋亡关键执行蛋白p-MLKL（Ser345）的水平显著升高（图3A和B）；相比之下，凋亡相关蛋白（Caspase-3、C-Caspase-3）、焦亡相关蛋白（GSDMD、N-GSDMD）以及铁死亡相关蛋白（GPX4）在Anxa2+/+与Anxa2−/−小鼠之间均无显著差异（图3C）。免疫组化进一步证实，p-MLKL特异性蓄积于KO小鼠髓质肾小管上皮细胞的顶膜（图3D），透射电镜也显示KO小鼠肾髓质顶膜破裂更为严重（图3E和F）。在体外实验中，研究人员利用TCMK-1细胞进行验证：ANXA2敲低可增强TSZ诱导的坏死性凋亡，表现为p-MLKL水平升高（图3G）；而ANXA2过表达则降低p-MLKL水平（图3H）。此外，顺利获得CCK-8实验、明场成像及流式细胞术检测，研究人员发现ANXA2过表达可促进细胞增殖并减少坏死性凋亡细胞比例，而敲低ANXA2则呈现相反效应（图3I-L）。

图3. 肾脏于IRI后24小时取材。体外实验中，顺利获得siRNA介导的敲低或质粒过表达调控TCMK-1细胞中ANXA2的表达，并使用TSZ试剂（1:1000稀释）诱导坏死性凋亡。（A）特异性分离肾髓质组织进行蛋白质印迹分析，以评估Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠IRI后关键坏死性凋亡标志物的蛋白水平。（B）使用ImageJ对蛋白质印迹条带进行灰度值定量分析。（C）为确定ANXA2缺失是否影响坏死性凋亡以外的细胞死亡通路，评估了凋亡及其他形式炎症性细胞死亡关键介导因子的表达。（D）进行p-MLKL的免疫荧光染色，以定位Anxa2−/−小鼠肾髓质中上调的p-MLKL表达。（E）采用透射电镜观察IRI后髓质肾小管上皮细胞顶膜的超微结构损伤，这是坏死性凋亡性细胞死亡的特征性表现。（F）对每个样本受伤外髓质的四个代表性视野进行成像，计算并平均每个视野中表现出严重顶膜破裂的肾小管上皮细胞占总细胞数的百分比。（G）利用TCMK-1细胞验证ANXA2在坏死性凋亡中的调控作用。ANXA2敲低后，用TSZ处理细胞以诱导坏死性凋亡，并比较对照组与敲低组中坏死性凋亡相关蛋白的表达水平。（H）检测对照、ANXA2敲低及ANXA2过表达TCMK-1细胞中ANXA2、MLKL和p-MLKL的蛋白水平。（I）采用明场显微镜评估对照、敲低和过表达组中坏死性凋亡的形态学特征。细胞于约40%汇合度时转染；转染后24小时加入TSZ，转染后72小时采集图像。（J）采用CCK-8法检测细胞增殖。（K）采用流式细胞术定量各组中坏死（主要为TSZ诱导的坏死性凋亡）细胞和凋亡细胞的比例。细胞于约40%汇合度时转染；转染后24小时加入TSZ，转染后72小时收集数据。（L）根据Annexin V和碘化丙啶（PI）染色确定坏死性凋亡细胞的比例。在TSZ刺激下，Annexin V+/PI+群体被共同归类为凋亡/坏死细胞。

（3）ANXA2顺利获得抑制坏死性凋亡驱动的炎症减轻肾脏IRI

由于现有研究表明坏死性凋亡与炎症密切相关且相互强化，研究团队第一时间评估了髓质组织中的炎症标志物。结果显示，与野生型小鼠相比，ANXA2敲除（KO）小鼠在IRI后Nlrp3、Tnf、Il6和Il1b的表达显著升高（图4A）。顺利获得流式细胞术分析髓系细胞浸润，研究人员发现Anxa2−/−小鼠肾脏中中性粒细胞浸润显著增加（图4B和C）。Ly-6G免疫组化染色进一步将增多的中性粒细胞定位至受损的外髓质区域（图4D和E）。与此一致，KO小鼠中中性粒细胞特异性趋化因子Cxcl1和Cxcl2的mRNA水平也显著上调（图4F）。在体外实验中，研究人员观察到TSZ诱导的TCMK-1细胞坏死性凋亡可促进CXCL1和CXCL2的分泌，而ANXA2过表达则能有效抑制这一效应（图4G）。为直接验证ANXA2的肾脏保护作用是否依赖于对坏死性凋亡的抑制，研究团队采用了特异性坏死性凋亡抑制剂Nec-1进行干预（图4H）。结果显示，Nec-1处理显著改善了野生型和KO小鼠的肾脏IRI损伤；值得注意的是，经Nec-1处理的KO小鼠其损伤程度与未处理的野生型小鼠相比无显著差异（图4I和J）。这一挽救效应顺利获得Havcr1和Lcn2表达的降低（图4K）、AQP1免疫荧光染色显示的肾小管结构保留（图4L）以及中性粒细胞浸润的减少（图4M和N）得到了进一步证实。

图4. ANXA2抑制肾小管上皮细胞坏死性凋亡并减轻IRI过程中的炎症和肾脏损伤。（A）分离肾髓质组织，对Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠进行RT-qPCR分析，检测坏死性凋亡相关炎症因子的mRNA水平。（B）处理全肾进行流式细胞术，评估IRI后的中性粒细胞浸润。中性粒细胞定义为CD45+ CD11b+ Ly-6G+ Ly-6Chi细胞。（C）定量CD45+ CD11b+白细胞中中性粒细胞的比例，以评估Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠的肾脏炎症。（D）进行Ly-6G免疫组化染色，以定位和定量肾损伤早期的中性粒细胞浸润。（E）在每个样本的损伤区域（主要为外髓质）三个预定视野中计数Ly-6G+细胞，并取平均值。（F）对Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠IRI后的髓质组织进行RT-qPCR，评估趋化中性粒细胞的趋化因子mRNA表达。（G）检测对照组、TSZ处理组和ANXA2过表达TSZ处理组的细胞培养上清液中的蛋白浓度。（H）Nec-1干预机制的示意图。（I）采用PAS染色评估有无Nec-1处理的Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠的组织学肾脏损伤。（J）使用标准化肾小管损伤评分系统评估皮质和髓质的组织病理学损伤。（K）对有无Nec-1处理的Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠进行RT-qPCR，评估Havcr1和Lcn2的mRNA表达。（L）在与（K）相同的实验条件下，进行AQP1免疫荧光染色以评估肾小管的结构完整性。（M）采用流式细胞术评估Nec-1对ANXA2缺失加重肾脏损伤的挽救效应，使用上述设门策略。（N）定量CD45+ CD11b+群体中中性粒细胞的百分比，以评估Nec-1对Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠IRI诱导肾脏炎症的影响。

（4）ANXA2与CHMP2A相互作用促进ESCRT-III组装并抑制坏死性凋亡

为阐明ANXA2抑制坏死性凋亡的分子机制，研究团队第一时间对IRI后的髓质组织进行了CO-IP-MS分析，将ESCRT-III膜修复复合物的核心组分CHMP2A鉴定为ANXA2的相互作用蛋白（图5A）。随后，研究人员利用膜蛋白提取物的免疫共沉淀实验证实，ANXA2在IRI后与CHMP2A发生相互作用，而在正常条件下两者不结合，且ANXA2不与其他ESCRT-III组分（CHMP2B、VPS24、CHMP4B和VPS4B）结合（图5B）。免疫荧光染色显示，IRI后ANXA2与CHMP2A共定位于肾小管细胞的顶膜（图5C）。膜蛋白分析进一步发现，Anxa2−/−小鼠中ESCRT-III组分的表达显著降低（图5D和E），且CHMP2A在缺失ANXA2时无法正确定位于顶膜（图5F）。在体外实验中，研究人员在TCMK-1细胞中敲低CHMP2A，发现这消除了ANXA2过表达对TSZ诱导坏死性凋亡的保护作用；CHMP2A敲低阻止了过表达ANXA2的膜定位，并导致坏死性凋亡增加（图5G）。顺利获得CCK-8实验和流式细胞术，研究人员进一步证实了ANXA2的保护作用依赖于CHMP2A（图5H-J）。这些结果表明，ANXA2顺利获得CHMP2A促进ESCRT-III复合物在顶膜的募集与组装，从而对抗坏死性凋亡。

图5. ANXA2与CHMP2A结合并促进ESCRT-III膜募集以在肾脏IRI后抵抗坏死性凋亡。肾髓质于IRI后24小时取材。在TCMK-1细胞中，使用siRNA敲低CHMP2A，并顺利获得质粒转染过表达ANXA2；使用TSZ试剂（1:1000）诱导坏死性凋亡。（A）将CO-IP-MS鉴定出的蛋白与已知的坏死性凋亡相关蛋白列表进行交集分析，以鉴定潜在相互作用蛋白。（B）进行免疫共沉淀实验以验证CHMP2A与ANXA2之间的相互作用，同时评估ANXA2与ESCRT-III复合物其他核心组分之间的相互作用。（C）采用免疫荧光染色观察Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠肾脏切片中ANXA2与CHMP2A的亚细胞共定位。（D）从肾髓质组织中提取蛋白后，分离质膜组分，随后进行蛋白质印迹分析以评估ESCRT-III复合物相关蛋白的膜定位。（E）使用ImageJ对蛋白质印迹信号进行灰度值定量分析。（F）进行CHMP2A的免疫组化染色，以确定其在Anxa2+/+和Anxa2−/−小鼠肾脏中的空间分布。（G）采用蛋白质印迹评估CHMP2A敲低和/或ANXA2过表达条件下坏死性凋亡信号的变化，特异性分析膜富集组分以评估ANXA2如何调控CHMP2A及其他ESCRT-III组分的膜结合。（H）在CHMP2A敲低和ANXA2过表达后，使用CCK-8法评估细胞增殖。（I）采用流式细胞术定量各实验组中坏死（主要为TSZ诱导的坏死性凋亡）细胞和凋亡细胞的比例。细胞于约40%汇合度时转染；转染后24小时加入TSZ，转染后72小时采集数据。（J）根据Annexin V和PI染色确定坏死性凋亡细胞的比例。

（5）肾脏富集型LNP在体外高效将ANXA2递送至肾小管上皮细胞

为开发治疗策略，研究团队第一时间构建并表征了负载ANXA2的脂质纳米颗粒（LNP）。透射电镜证实LNP保持球形形态，且ANXA2蛋白成功包封于囊泡内部（图6A）。针对ANXA2的蛋白质印迹分析在LNP@ANXA2样本中显示出特异性条带，验证了其高载药量（图6B）。动态光散射的理化表征显示，LNP@ANXA2的水动力直径为164.7 nm，略大于空载LNP（图6C）；其zeta电位为15.4 mV，与空载LNP相比略高且随时间保持稳定，表明体外胶体稳定性良好（图6D和E）。随后，研究人员评估了LNP@ANXA2的生物相容性。CCK-8细胞毒性实验显示，TCMK-1肾小管上皮细胞在各测试浓度下均未出现显著细胞毒性，而pGEC内皮细胞在最高浓度250 μg/mL时存活率降至约80%，提示该剂量下存在轻度毒性（图6F）。进一步的1、3、7天增殖实验证实，重组ANXA2、空载LNP及LNP@ANXA2均未显著影响TCMK-1或pGEC细胞的增殖速率（图6G和H）。活/死细胞染色进一步支持上述结果，显示经LNP或LNP@ANXA2处理的细胞保持高存活率（>95%），且各组间增殖趋势相似（图6I-K）。

为实现肾脏增强递送并最小化潜在的全身副作用，研究团队将肾脏靶向肽（KTP）偶联至LNP表面，制备了KTP-LNP@ANXA2。研究人员系统评估了该修饰纳米颗粒的理化性质和载药性能，证实其具有优异的胶体均一性和稳定性，以及良好的批间重现性。蛋白定量分析显示KTP-LNP@ANXA2实现了约80%的高包封率和16%的载药量，体外释放动力学呈现72小时内持续释放的特征。随后，研究人员评估了修饰纳米颗粒的细胞摄取和肾脏积累能力。共聚焦显微镜和流式细胞术分析显示，与DiI标记的KTP-LNP@ANXA2共孵育的TCMK-1细胞呈现时间依赖性的细胞内荧光强度增加，证实了成功且高效的细胞摄取（图6L-M）。为评估KTP-LNP@ANXA2能否跨越血管内皮屏障并在肾小管上皮细胞中蓄积，研究团队采用Transwell共培养系统，在上室接种内皮细胞形成内皮屏障，下室培养TCMK-1细胞（图6O）。与DiI标记纳米颗粒共孵育12小时后，下室TCMK-1细胞在KTP-LNP@ANXA2处理组中显示出显著高于未修饰LNP@ANXA2组的荧光强度（图6P和Q），表明KTP修饰显著增强了纳米颗粒的跨内皮转运和肾小管上皮细胞靶向蓄积能力。

图6.（A）顺利获得透射电镜评估纳米颗粒形态。LNP组和LNP@ANXA2组均呈球形结构，证实纳米颗粒成功形成。（B）蛋白质印迹证实ANXA2蛋白成功载入LNP（LNP@ANXA2）。（C）顺利获得动态光散射测量LNP和LNP@ANXA2的水动力尺寸分布和散射强度。（D）分析表面zeta电位以评估LNP和LNP@ANXA2的胶体稳定性。（E）为评估储存稳定性，随时间监测纳米颗粒的粒径分布。（F）将TCMK-1和pGEC暴露于不同浓度的LNP@ANXA2 24小时后评估其细胞毒性。（G）顺利获得CCK-8法评估TCMK-1和（H）pGEC的细胞增殖。（I）对TCMK-1和（J）pGEC进行活/死细胞染色以评估细胞活力。（K）顺利获得活细胞百分比定量确定存活率。（L）与KTP-LNP@ANXA2共孵育不同时间后，顺利获得共聚焦成像和流式细胞术分析其在TCMK-1细胞中的摄取动力学。（M）流式细胞术和（N）定量分析结果显示，LNP被细胞成功内吞，且呈时间依赖性。（O）血管穿透实验模型的示意图。（P）DiI标记的LNP@ANXA2或KTP-LNP@ANXA2共孵育后穿过pGEC细胞并靶向TCMK-1细胞的情况。（Q）共聚焦定量分析结果显示，KTP-LNP@ANXA2能够穿过pGEC细胞并被TCMK-1细胞内吞。

（6）肾脏富集型ANXA2-LNP预处理在体内减轻肾脏IRI

研究团队第一时间顺利获得体内成像评估了纳米颗粒的肾脏分布特征。结果显示，静脉注射的KTP-LNP@ANXA2与未修饰的LNP@ANXA2相比，表现出增强的肾脏蓄积和更稳定的滞留效应（图7A-E）。蛋白质印迹进一步证实，KTP-LNP@ANXA2预处理成功将肾脏ANXA2蛋白水平提升至与IRI诱导后相当的程度（图7F和G）。这种预处理策略显著减轻了肾脏IRI损伤，表现为组织学改善（图7H和I）以及Havcr1和Lcn2表达的降低（图7J）。在机制层面，研究人员证实KTP-LNP@ANXA2预处理显著抑制了坏死性凋亡（表现为p-MLKL水平降低），并下调了坏死性凋亡相关炎症因子（包括Nlrp3、Il6、Il1b和Tnf）的表达（图7K-M）。相应地，受损肾脏中的中性粒细胞浸润显著减少（图7N和O）。这些发现共同证明了肾脏富集型ANXA2递送系统在预防肾脏IRI方面的治疗潜力。

图7.（A）尾静脉注射后不同时间点LNP@ANXA2或KTP-LNP@ANXA2在肾脏中的蓄积特征。（B）顺利获得荧光检测评估LNP@ANXA2和KTP-LNP@ANXA2的器官分布。（C）注射后2小时、（D）6小时和（E）12小时两种制剂在各器官中的蓄积水平定量分析。（F）从全肾中提取总蛋白，顺利获得蛋白质印迹检测注射KTP-LNP@ANXA2后肾脏中ANXA2的表达水平。（G）使用ImageJ对蛋白质印迹进行灰度值定量分析。（H）PAS染色及（I）溶剂对照组和KTP-LNP@ANXA2注射组小鼠的肾小管损伤评分。（J）对溶剂对照组和KTP-LNP@ANXA2注射组小鼠进行RT-qPCR，评估Havcr1和Lcn2的mRNA表达。（K）从全肾中提取总蛋白，顺利获得蛋白质印迹检测注射KTP-LNP@ANXA2后IRI肾脏中ANXA2、MLKL和p-MLKL的表达水平。（L）使用ImageJ对蛋白质印迹进行灰度值定量分析。（M）分离肾髓质组织，对溶剂对照组和KTP-LNP@ANXA2注射组小鼠进行RT-qPCR，分析坏死炎症因子的mRNA水平。（N）采用流式细胞术评估KTP-LNP@ANXA2对IRI后肾脏中性粒细胞浸润的调控作用，使用上述设门策略。（O）定量CD45+ CD11b+群体中中性粒细胞的百分比，以评估KTP-LNP@ANXA2对IRI诱导肾脏炎症的影响。