球盟会(中国)

针对上述问题，华中科技大学刘国辉联合华南理工大学边黎明、张琨雨团队设计了一种具有可逆主-客体物理交联网络的细胞自适应动态HA-ADA水凝胶，发现具有高度动态自适应网络的HA-ADA水凝胶能显著促进人骨髓间充质干细胞（hMSCs）的铺展和成骨分化。机制研究揭示，HA-ADA水凝胶顺利获得下调miR-376a-3p和miR-127-5p的表达，解除其对甲基转移酶SETD7的抑制，进而促进β-catenin的甲基化及核转位；在细胞核内，β-catenin与YAP协同激活转录程序，驱动成骨谱系承诺。该研究阐明了细胞自适应水凝胶顺利获得机械-表观遗传耦合通路指导细胞命运的分子机制，为设计促进骨再生的生物活性材料给予了理论依据。该文章于2026年2月11日以《Dynamic hydrogels orchestrate the differentiation fate of mesenchymal stem cells through epigenetic regulation of SETD7 to accelerate bone defect repair》为题发表于《Bioactive Materials》（DOI：10.1016/j.bioactmat.2026.01.019）。

HA-ADA水凝胶系统顺利获得动态基质介导的力学传导增强骨再生的示意图

(1) 动态水凝胶的开发与表征

顺利获得¹H核磁共振波谱确认了Ac-β-CD、胆酸修饰透明质酸（HA-CA）和金刚烷修饰透明质酸（HA-ADA）的成功合成，其中HA-CA和HA-ADA的取代度均为0.30（图1a-c）。扫描电子显微镜显示HA-CA水凝胶呈现小而致密的孔结构，而HA-ADA水凝胶具有更大、更开放的孔结构（图1d）。流变学测量表明HA-ADA水凝胶的储能模量和G'/G″比值均低于HA-CA水凝胶（图1e）；压缩测试进一步显示HA-ADA水凝胶的压缩模量显著低于HA-CA水凝胶。应力松弛实验中，HA-ADA水凝胶的τ₁/₂为13秒，而HA-CA水凝胶为208秒（图1f）。降解动力学研究表明HA-ADA水凝胶的降解速率高于HA-CA水凝胶。将人骨髓间充质干细胞包封于水凝胶中并经蓝光交联后，扫描电子显微镜显示HA-ADA水凝胶具有更均匀且多孔的结构（图1g、h）。活/死染色显示培养24小时和72小时后，HA-ADA水凝胶中的细胞存活率和增殖能力均优于HA-CA水凝胶（图1i、j），CCK-8检测进一步证实了HA-ADA水凝胶中更高的细胞活力。

图1. HA-CA和HA-ADA水凝胶的制备与表征。 (a) Ac-β-CD的¹H NMR谱图。(b) HA-CA的¹H NMR谱图。(c) HA-ADA的¹H NMR谱图。(d) HA-CA和HA-ADA水凝胶的扫描电镜图像。(e) HA-CA和HA-ADA水凝胶的流变学性能。(f) HA-CA和HA-ADA水凝胶的应力松弛曲线。(g) 将人骨髓间充质干细胞（hMSCs）包封于HA-CA和HA-ADA水凝胶中的流程示意图。(h) 包封hMSCs后HA-CA和HA-ADA水凝胶的扫描电镜图像。(i) 培养24小时或72小时后，HA-CA和HA-ADA水凝胶中包封hMSCs的代表性活/死染色图像。(j) (i)中细胞存活率的定量分析。

（2）HA-ADA水凝胶调控hMSCs的分化

共聚焦三维成像显示，HA-ADA水凝胶中的人骨髓间充质干细胞（hMSCs）呈现广泛铺展并建立细胞间接触，而HA-CA水凝胶中的细胞保持球形且伸展受限（图2a）。F-actin染色三维重建显示HA-ADA水凝胶中的hMSCs形成复杂的三维细胞骨架网络，具有广泛的丝状伪足和片状伪足，而HA-CA水凝胶中的细胞维持球形肌动蛋白结构。二维成像进一步证实，培养24小时和72小时后，HA-CA水凝胶中的细胞主要保持圆形，而HA-ADA水凝胶中的细胞呈现广泛铺展（图2b）。在成骨或成脂诱导培养后，HA-ADA水凝胶中的hMSCs表现出显著增强的碱性磷酸酶（ALP）活性和茜素红S（ARS）阳性矿化结节，但油红O（ORO）阳性脂质积累明显减少（图2c）。蛋白质印迹分析显示，与HA-ADA水凝胶相比，HA-CA水凝胶中的hMSCs表达较低水平的成骨标志物Runx2和骨钙素（OCN），但较高水平的成脂标志物PPARγ（图2d、e）。实时定量PCR分析进一步证实，HA-ADA水凝胶中的hMSCs表达显著更高水平的RUNX2和ALP mRNA，以及更低水平的PPARG mRNA（图2f）。

图2.HA-ADA水凝胶调控hMSCs的分化命运。 (a) 包封于HA-CA和HA-ADA水凝胶中细胞的F-肌动蛋白细胞骨架（鬼笔环肽染色）三维渲染图像。(b) hMSCs包封于HA-CA和HA-ADA水凝胶网络中的细胞骨架染色图像。(c) 指定时间成骨或成脂诱导后碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S（ARS）和油红O（ORO）染色的代表性图像。(d) 指定时间诱导后，从HA-CA和HA-ADA水凝胶中收集的hMSCs成骨标志物（Runx2、OCN）和成脂标志物（PPARγ）蛋白水平的蛋白质印迹分析。(e) 蛋白质印迹结果的定量分析。n = 3。(f) qRT-PCR检测RUNX2、ALP和PPARG的mRNA表达水平。

（3）HA-ADA水凝胶中hMSCs的miR-376a-3p和miR-127-5p下调且共同靶向SETD7

高通量miRNA测序显示，与HA-CA水凝胶相比，HA-ADA水凝胶上调19个miRNA并下调13个miRNA，其中miR-376a-3p和miR-127-5p下调最为显著，表达量均降低两倍以上（图3a-b）。qRT-PCR验证了该结果（图3c）。TargetScanHuman 8.0和miRWalk预测miR-376a-3p与miR-127-5p共有三个靶基因：SETD7、MBD5和ABI2（图3d）。双荧光素酶实验证实，miR-376a-3p和miR-127-5p可降低SETD7的荧光素酶活性，但对MBD5和ABI2无影响（图3e-f）；野生型与突变型SETD7 mRNA构建体的报告基因实验进一步表明，两种miRNA均显著降低野生型SETD7的荧光素酶活性，而对突变型无显著作用（图3g-i）。Western blot结果显示，miR-376a-3p和miR-127-5p模拟物降低SETD7蛋白水平及成骨标志物Runx2、OCN的表达，其抑制剂则上调上述蛋白表达（图3j）。ALP、ARS和ORO染色表明，模拟物显著降低ALP活性与ARS阳性面积、增加ORO阳性面积，而抑制剂呈现相反效应，且两种抑制剂联用对成骨的促进作用最强（图3k-p）。综上，HA-ADA水凝胶顺利获得下调miR-376a-3p和miR-127-5p上调SETD7表达。

图3. miR-376a-3p和miR-127-5p在HA-ADA水凝胶包封的hMSCs中下调，并共同靶向SETD7。 (a) 火山图展示HA-CA与HA-ADA水凝胶包封hMSCs测序数据中差异表达的miRNAs。(b) HA-CA和HA-ADA水凝胶中hMSCs测序得到的miRNA表达谱热图。(c) HA-CA和HA-ADA水凝胶中培养的hMSCs中miR-376a-3p和miR-127-5p的表达水平。n = 3。(d) Venn图显示TargetScan和miRWalk预测的miR-376a-3p和miR-127-5p重叠靶基因。(e, f) miR-376a-3p和miR-127-5p靶点验证的双荧光素酶报告基因实验。n = 3。(g) miR-376a-3p和miR-127-5p在SETD7 3'UTRs上的预测结合位点，及构建的SETD7突变型示意图。(h, i) 评估miR-376a-3p (h)和miR-127-5p (i)与野生型和突变型SETD7序列相互作用的双荧光素酶报告基因实验。n = 3。(j) hMSCs转染miR-376a-3p或miR-127-5p模拟物或抑制剂后，经4天成骨诱导的SETD7、Runx2和OCN蛋白水平的蛋白质印迹分析。(k–m) hMSCs转染miR-376a-3p或miR-127-5p模拟物或抑制剂后，经指定时间成骨或成脂诱导的ALP、ARS和ORO染色。(n–p) ALP活性（OD值）(n)、ARS阳性面积(o)和ORO阳性面积(p)的定量分析。

（4）hMSCs中SETD7上调促进成骨分化

Western blot分析显示，HA-ADA水凝胶培养的hMSCs中SETD7蛋白表达水平显著高于HA-CA水凝胶（图4a）。SETD7过表达增强了ALP活性、ARS染色，并减少了ORO染色（图4c-d）；而SETD7敲低则降低了ALP活性、ARS阳性面积，并显著增加了ORO阳性面积（图4f-g）。(R)-PFI-2（SETD7甲基转移酶抑制剂）处理显著抑制了SETD7甲基转移酶活性（图4h），经抑制剂处理的细胞表现出ALP活性降低、ARS染色减少及ORO染色增强（图4i-j）。上述结果表明，与静态HA-CA水凝胶相比，HA-ADA水凝胶顺利获得上调hMSCs中SETD7蛋白表达促进成骨分化。

图4. hMSCs中上调的SETD7促进成骨分化。 (a) HA-CA和HA-ADA水凝胶包封hMSCs中SETD7表达的蛋白质印迹分析。(b) hMSCs过表达SETD7后SETD7蛋白水平的蛋白质印迹检测。(c) 过表达SETD7的hMSCs经指定时间成骨或成脂诱导后的ALP、ARS和ORO染色。(d) (c)中ALP活性（OD值）、ARS阳性面积和ORO阳性面积的定量分析。n = 3。(e) hMSCs敲低SETD7后SETD7蛋白表达的蛋白质印迹测定。(f) SETD7敲低hMSCs经指定时间成骨或成脂诱导后的ALP、ARS和ORO染色。(g) (f)中ALP活性（OD值）、ARS阳性面积和ORO阳性面积的定量分析。n = 3。(h) SETD7甲基转移酶活性测定。(i) (R)-PFI-2处理的hMSCs经指定时间成骨或成脂诱导后的ALP、ARS和ORO染色。(j) (i)中ALP活性（OD值）、ARS阳性面积和ORO阳性面积的定量分析。

（5）SETD7介导的β-catenin甲基化促进其核积聚且需与核内YAP结合以发挥成骨活性

Gene Ontology富集分析显示，Wnt信号通路在预测靶基因中显著富集（图5a）。Co-IP分析表明，与HA-CA水凝胶相比，HA-ADA水凝胶培养的hMSCs中β-catenin与SETD7的相互作用增强，β-catenin甲基化水平升高，且核β-catenin水平显著增加（图5b-e）。SETD7过表达显著增强了SETD7与β-catenin的关联及β-catenin甲基化水平，并提高了核β-catenin水平（图5f-i）；而SETD7沉默则降低了SETD7-β-catenin相互作用、β-catenin甲基化及核β-catenin水平（图5j-m）。HA-ADA水凝胶培养的hMSCs中核YAP水平及YAP与β-catenin的核相互作用均高于HA-CA水凝胶（图5n-q），免疫荧光共定位进一步证实了YAP与β-catenin的共定位（图5r）。YAP沉默显著减少了核β-catenin-YAP结合并减弱了成骨效应，且该效应无法被SETD7过表达逆转（图5s-u）。上述结果表明，SETD7顺利获得介导β-catenin甲基化促进其核转位，进而在核内与YAP形成复合物驱动hMSCs成骨分化。

图5. SETD7介导的β-catenin甲基化增强其核积累，并需要与核YAP结合以发挥成骨活性。 (a) 预测miRNA靶点的GO分析（前20个条目）。(b) HA-CA和HA-ADA水凝胶中hMSCs细胞质β-catenin复合物的免疫共沉淀，免疫印迹检测SETD7和甲基化赖氨酸。(c) 核β-catenin和H3水平。(d, e) (b)和(c)的定量分析。(f) SETD7过表达后的免疫共沉淀分析（MOI = 20，转导12小时，培养48小时）。(g) SETD7过表达后的核β-catenin水平。(h, i) (f)和(g)的定量分析。(j) SETD7敲低后的免疫共沉淀分析（MOI = 10，转导24小时，培养48小时）。(k) SETD7沉默后的核β-catenin水平。(l, m) (j)和(k)的定量分析。(n, o) 核YAP和H3表达及其定量分析。(p, q) HA-CA和HA-ADA水凝胶中培养的hMSCs核YAP-β-catenin相互作用的免疫共沉淀分析。(r) 免疫荧光检测β-catenin/YAP共定位。(s) 基因沉默后的β-catenin和YAP染色。(t, u) 敲低后成骨分化的ARS染色和定量分析。

（6）负载rMSCs的动态水凝胶促进骨修复

自体骨髓间隙充质干细胞（rMSCs）移植受限于缺陷部位失衡的微环境。基于动态水凝胶（HA-ADA）能够顺利获得调节基质动力学敏感型 miRNA 影响干细胞分化的前期研究，本实验利用大鼠股骨外髁骨缺陷模型（直径 3.0 mm）评价了 HA-ADA 负载 rMSCs 的治疗潜力（图6a）。术后 8 周，主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）的 H&E 染色证实该材料无明显毒性。Micro-CT 及组织学分析显示，术后 4 周和 8 周，HA-ADA + MSCs 组的骨再生效果优于对照组。在加入 miRNA mimics 后，该修复效应显著减弱；而加入 miRNA inhibitors 后，修复效果显著增强（图6b-e）。免疫组化分析表明，Runx2 和 SETD7 的蛋白表达量在 inhibitors 组中最高，其次为 MSCs 组和 mimics 组（图6f）。Western blot 结果证实，各组骨痂组织中核内 $\beta$-catenin 的表达水平与骨修复效能趋势一致。综上所述，HA-ADA 水凝胶顺利获得下调 miR-376a-3p 和 miR-127-5p 的表达，解除其对 SETD7 的抑制，从而促进 MSCs 的成骨分化并加速骨修复。

图6. 负载MSCs的动态水凝胶促进骨修复。 (a) 动物实验设计示意图。(b) 植入后4周和8周，对照组、ADA + MSCs组、ADA + MSCs@mimics组和ADA + MSCs@inhibitors组股骨髁的micro-CT评估。(c) 4周和8周时缺损区域骨密度（BMD）的定量分析。n = 3。(d) 4周和8周时缺损区域骨体积分数（BV/TV）的定量分析。n = 3。(e) H&E染色对股骨缺损的组织学分析。(f) 4周和8周时股骨缺损区域Runx2和SETD7的免疫组织化学染色。