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研究背景：

针对上述问题，北京大学第三医院骨科周方、北京市生物医学工程高精尖创新中心刘海峰团队研究了一种多功能复合水凝胶（GCPM），顺利获得将聚多巴胺修饰的氧化铈纳米颗粒（CeO₂@PDA）和镁离子（Mg²⁺）共载于明胶甲基丙烯酰（GelMA）水凝胶中，利用光交联技术制备而成。该水凝胶具有优异的抗氧化、抗炎、促成骨和促血管生成能力，能够改善骨质疏松病理微环境。GCPM水凝胶在体外能有效清除活性氧（ROS）、促进骨髓间充质干细胞成骨分化，并诱导巨噬细胞向M2型极化；在体内骨质疏松大鼠颅骨缺损模型中，显著加速了新骨形成和血管重建，展现出良好的骨修复效果与生物相容性。该文章于2025年4月28日以《Multifunctional Nanoparticle Reinforced GelMA Hydrogel for Osteoporotic Pathophysiological Microenvironment Improvement and Bone Defect Regeneration》为题发表于《Advanced Functional Materials》（DOI：10.1002/adfm.202505063）。

研究示意图

（1）不同纳米颗粒及纳米复合水凝胶的表征分析

顺利获得SEM和TEM分析，所有纳米颗粒配方（C、CP和CPM）均表现出均匀的粒径分布。CeO₂纳米颗粒表面包裹有一层薄膜（图1A、B）。PDA和Mg²⁺在CeO₂纳米颗粒上的涂层顺利获得FTIR测试（图1C）。EDS映射图像显示Ce、O和Mg元素均匀分布，证明PDA和Mg²⁺成功包裹在CeO₂纳米颗粒中形成CPM纳米颗粒（图1D、E）。SEM图像显示所有水凝胶均具有互联的、均匀的、松散多孔的内部结构，孔径范围为100至400μm（图1F）。

图1 不同纳米颗粒和纳米复合水凝胶的表征。(A) C、CP、CPM纳米颗粒的SEM图像；(B) C、CP、CPM纳米颗粒的TEM图像；(C) C、CP、CPM纳米颗粒的FTIR光谱；(D、E) C和CPM纳米颗粒的EDS元素图像；(F) G、GC、GCP和GCPM水凝胶的SEM图像

（2）不同纳米复合水凝胶的表征

EDS结果表明，C、N、O和Ce元素均匀分布在GC、GCP和GCPM水凝胶中，而GCPM水凝胶含有镁元素（图2A, B）。FTIR分析结果进一步确认了C、CP和CPM纳米颗粒成功掺入GelMA水凝胶中（图2C）。水凝胶的亲水性顺利获得吸水率检测（图2D）进行评估，G、GC、GCP和GCPM水凝胶在24小时观察中表现出良好的亲水性。FTIR分析结果进一步确认了C、CP和CPM纳米颗粒成功掺入GelMA水凝胶中（图2C）。水凝胶的亲水性顺利获得吸水率检测（图2D）进行评估，G、GC、GCP和GCPM水凝胶在24小时观察中表现出良好的亲水性。力学性能测试显示，纯GelMA水凝胶（G）压缩应力最低，而含纳米粒子水凝胶（GC、GCP、GCPM）压缩应力依次升高，其中GCPM组最高（图2E,F）。流变学分析表明所有水凝胶储能模量（G''）均高于损耗模量（G'），且含纳米粒子组G''显著高于纯GelMA组，GCPM组提升最显著（图2G-K）。降解实验显示纯GelMA水凝胶（G）降解速率显著快于含纳米粒子组（GC、GCP、GCPM）（图2L）。缓释性能测试表明所有含纳米粒子水凝胶均能稳定释放Ce元素，且GCPM组可有效释放Mg离子（图2M,N）。

图2 不同纳米复合水凝胶的表征。（A、B）G、GC、GCP和GCPM水凝胶的EDS图像；（C）G、GC、GCP和GCPM水凝胶的FTIR谱图；（D）G、GC、GCP和GCPM水凝胶的动态膨胀行为；（E、F）不同水凝胶的压缩应力-应变曲线及压缩模量；（G–K）G、GC、GCP和GCPM水凝胶的流变频率扫描；（L）G、GC、GCP和GCPM水凝胶的降解速率；（M、N）Ce和Mg的释放曲线

（3）体外生物相容性评价

图3A显示，在所有组别的第1天和第3天，仅观察到极少数死细胞，表明复合水凝胶具有细胞友好性。CCK-8结果（图3B, C）表明，BMSCs在G、GC、GCP和GCPM水凝胶中的增殖没有显著差异。细胞骨架染色显示，BMSCs在不同水凝胶中充分铺展并延伸出触角（图3D）。

图3 体外生物相容性评价。(A) BMSCs在第1天和第3天的活死染色图像；(B、C) 第1天和第3天的CCK-8分析；(D) 各种纳米复合水凝胶中BMSCs的F-actin和细胞核免疫荧光图像

（4）体外ROS清除能力评价

结果表明，HG组在第1天和第3天的死亡细胞显著增加，而HGC、HGCP和HGCPM组的死亡细胞数量较少，表明这些水凝胶具有保护作用（图4A、B）。CCK-8分析结果进一步确认，HG组的细胞增殖较差，而HGC、HGCP和HGCPM组则显著改善了细胞增殖（图4C、D）。HG组显示强烈的ROS荧光信号（图4E），而HGC、HGCP和HGCPM组的ROS信号显著降低，表明GC、GCP和GCPM水凝胶能有效清除过量的细胞内ROS（图4E, F, G）。线粒体膜电位（MMP）评估显示，HG组MMP显著降低，而GC、GCP和GCPM水凝胶组MMP得到恢复，表明其能够顺利获得有效的ROS清除能力诱导线粒体功能的恢复（图4H）。

图4 体外ROS清除能力评估。（A、B）在H₂O₂处理下，第1天和第3天BMSCs的活死细胞染色；（C、D）在H₂O₂处理下，第1天和第3天不同水凝胶的CCK-8分析；（E）BMSCs内源性ROS的代表性图像；（F、G）流式细胞术分析BMSCs内源性ROS的图像；（H）顺利获得JC-1染色确定的BMSCs的线粒体膜电位（MMP）

（5）体外成骨评价

ALP染色结果表明，氧化应激显著抑制BMSCs的早期成骨分化能力，但HGC、HGCP和HGCPM组的抑制作用明显减弱（图5A）。ARS染色结果与ALP染色结果一致，表明HGC、HGCP和HGCPM组促进了晚期成骨分化（图5B）。ALP活性和半定量ARS分析也证实了HGC、HGCP和HGCPM组促进骨分化的能力（图5C, D）。qPCR和免疫荧光染色结果显示，氧化应激显著抑制成骨相关基因的表达（图5E-L）和成骨相关蛋白的表达（图5M-R），而GC、GCP和GCPM水凝胶可以缓解这种抑制作用，并显著增强成骨分化相关基因和蛋白的表达，其中GCPM组表现出最强的成骨分化潜力。

图5 体外成骨能力评估。（A）第14天ALP染色的代表性图像；（B）第21天ARS染色的代表性图像；（C）第14天BMSCs的ALP活性；（D）ARS染色定量分析钙沉积；（E–H）第3天BMSCs成骨相关基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）表达；（I–L）第5天BMSCs成骨相关基因（Col 1、Runx-2、ALP和OCN）表达；（M–R）BMSCs的免疫荧光强度半定量分析及Col 1、Runx-2和OCN的代表性免疫荧光染色图像

图6 体外免疫调节能力评估。（A–C）RAW264.7细胞M1极化相关标志物及促炎细胞因子mRNA表达（iNOS、TNF-α和IL-6）；（D、E）RAW264.7细胞M2极化相关标志物及抗炎细胞因子mRNA表达（CD206和IL-10）；（F–H）RAW264.7细胞中TNF-α、IL-6和IL-10的ELISA检测结果；（I、J）RAW264.7细胞M1和M2极化标志物的免疫荧光染色图像

（7）体外血管生成评价

GCPM组的细胞迁移水平最高，伤口愈合显著增强（图7A、B）。转移实验结果显示，GCPM组HUVECs的迁移数量明显高于其他组（图7C、D）。管形成实验结果显示，GCPM组形成的毛细血管网络更为完善（图7E、F），表明GCPM水凝胶具有优越的血管生成生物学效应。qPCR结果表明，VEGFR2、VEGF和HIF-1α在GCPM组中显著表达（图7G-L）。免疫荧光染色显示，GCPM组中VEGFR2和HIF-1α的免疫荧光强度显著增强（图7M-P）。

图7 体外血管生成能力评估。（A）血管内皮细胞划痕实验图像；（B）划痕实验的定量分析；（C）Transwell实验的代表性图像；（D）Transwell实验的定量分析；（E）管形成实验的代表性图像；（F）管形成结构的定量分析；（G–I）HUVECs在第1天的血管生成相关基因表达；（J–L）HUVECs在第3天的血管生成相关基因表达；（M–P）免疫荧光染色的半定量分析及代表性图像

（8）体内新骨形成评价

为评估纳米复合水凝胶在骨质疏松骨缺损中的骨再生能力，研究建立了C57BL/6小鼠双侧卵巢切除术的稳定骨质疏松模型（图8A）。卵巢切除术导致体重减轻（图8B），且第8周时，OVX组的子宫重量显著低于假手术组（图8C）。OVX组股骨骨矿物质密度降低，骨小梁稀疏且不陆续在（图8D）。HE染色和TRAP染色结果表明，成功建立了小鼠骨质疏松模型（图8E, F）。3D重建、矢状位和冠状位视图显示（图8G），与OVX组相比，假手术组具有更多的新骨组织，表明在骨质疏松条件下骨修复能力受损。

图8 体内新生骨形成评估。(A) 骨质疏松建模及纳米复合水凝胶体内成骨示意图；(B) 双侧卵巢切除术后小鼠体重变化；(C) 双侧卵巢切除术后子宫重量；(D) 股骨远端骨质疏松代表性Micro-CT图像；(E) 股骨远端H&E染色代表性图像；(F) 股骨远端TRAP染色代表性图像；(G) 愈合骨缺损周围新生骨的Micro-CT图像三维重建和切面代表性图像；(H,I) 再生骨组织BV和BV/TV的定量分析

（9）体内新骨形成评价

OVX组在骨缺损边缘观察到最少的新骨组织，表明骨质疏松条件下骨修复能力差（图9A）。Masson三色染色结果表明，OVX组在缺损区域有少量胶原纤维和纤维组织，而GC、GCP和GCPM组的缺损区域充满了胶原纤维和新骨组织（图9B）。IHC染色用于研究纳米复合水凝胶在骨质疏松骨修复中的成骨和血管生成作用。OVX组的Col 1和OCN表达最低（图9C, D）。GC、GCP和GCPM组观察到Col 1和OCN表达显著增加。与GC和GCP组相比，GCPM组的Col 1和OCN表达有所降低。CD31染色结果表明，GCPM组的CD31阳性细胞数量明显高于其他组（图10A）。H&E染色结果表明，所有组的小鼠在术后8周内状况良好，GC、GCP和GCPM组均具有良好的体内生物相容性（图10B）。

图9 体内新骨形成评估。（A）骨缺损区域的H&E染色代表性图像；（B）骨缺损区域的Masson三染色代表性图像；（C）Col 1免疫组化染色代表性图像；（D）OCN免疫组化染色代表性图像

图10 体内新生骨形成评估。(A) CD31免疫组织化学染色代表性图像；(B) 包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏在内的主要器官的H&E染色代表性图像