球盟会(中国)

针对上述问题，山东大学薛皓教授团队设计了一个多模式生物模拟纳米平台（FBFO@HM@aOPN），旨在增强GBM中PDT-免疫疗法的协同作用。该纳米平台将具有双酶活性的纳米酶（Fe3O4@BiFeO3，FBFO）包裹在由OMVs和M1EVs融合形成的杂化膜（HM）中，然后与pH敏感的抗OPN（aOPN）抗体结合以取得FBFO@HM@aOPN。静脉注射后，FBFO@HM@aOPN在GBM组织中积累，其中酸性TME触发的aOPN释放增加了血管通透性并促进了ECM重塑。同时，FBFO纳米酶产生氧气以缓解缺氧，提高了PDT的效率。HM进一步指导纳米平台靶向肿瘤细胞和TAMs，诱导铁死亡（释放新抗原）并将TAMs重新极化为M1样表型。这种双重作用激活了先天和适应性免疫，与检查点抑制剂协同作用，抑制了肿瘤的进展和复发。该文章于2025年8月18日以《Bioengineered hybrid dual-targeting nanoparticles reprogram the tumour microenvironment for deep glioblastoma photodynamic therapy》为题发表于《Nature communications》（DOI：10.1038/s41467-025-63081-2）。

图1 研究示意图

（1）FBFO@HM@aOPN纳米粒子的制备与表征

第一时间，采用溶热法合成了Fe₃O₄纳米粒子（NPs）。随后，向Fe₃O₄NPs中添加Bi³⁺和PVP，顺利获得原位生长法取得FBFO NPs（图1a）。透射电子显微镜（TEM）显示FBFO NPs的平均直径约为30纳米（图2a）。进一步顺利获得扫描透射电子显微镜（STEM）结合能量色散X射线光谱（EDX）和能量色散光谱（EDS）分析确认了FBFO NPs中含有Bi、Fe和O元素，如图2b所示。X射线衍射（XRD）也证实了FBFO NPs的成功合成，如图2c所示。这些结果共同验证了FBFO NPs的成功合成。光学性质是影响FBFO NPs光催化活性的主要因素。紫外-可见/近红外光谱（UV-vis/NIR）显示，Bi和Fe₃O₄ NPs的掺杂拓宽了FBFO的光吸收范围（图2d），提高了光生载流子的分离效率，极大地增强了纳米材料的光催化活性。如图2e所示的方案，顺利获得660纳米激光照射（方程1）可以实现有效的空穴（h⁺）-电子（e⁻）对分离，随后与水和氧气结合，可以产生大量的羟基自由基（·OH）和超氧自由基（·O₂⁻）用于I型光动力疗法（PDT）（方程2和3）。随着Fe²⁺进一步转变为Fe³⁺，H₂O₂被转化为·OH（方程4，模拟过氧化物酶，POD），这进一步增加了活性氧（ROS）的产生。产生的h⁺还可以将H₂O₂氧化产生O₂（方程5，模拟过氧化氢酶，CAT），以维持缺氧TME中的光动力疗法。接下来，顺利获得亚甲蓝（MB）降解和溶解氧分析仪实验评估了NPs在660纳米（0.5 W/cm²）激光照射下产生ROS和O₂的能力。与Fe₃O₄组和其他组相比，FBFO组和激光组的MB吸收明显显著降低，而O₂产生能力显著增加（图2f，g）。此外，顺利获得电子自旋共振（ESR）光谱验证了FBFO NPs介导的光动力疗法中ROS（·OH和·O₂⁻）的产生（图2h）。因此，FBFO NPs表现出优异的催化活性，用于产生ROS（·OH和·O₂⁻）和O₂，表明FBFO NPs在抗肿瘤PDT应用中具有巨大潜力。

为了进一步提高FBFO的安全性、稳定性和多功能性，用M1巨噬细胞来源的外泌体（M1EVs）和细菌膜囊泡（OMVs）的杂化膜（HM）包裹FBFO，取得了FBFO@HM NPs（图1b）。将分泌的OMVs以1:1的比例加入M1EVs中，孵育2小时，随后超声处理10分钟，并在液氮中冻融5次，以取得M1EV-OMV HMs。之后，将HMs和FBFO NPs经过10次脂质体挤出器挤出，形成相对均匀的FBFO@HM NPs。CLSM证实FBFO@HM NPs的表面被N₃修饰的M1EVs所包裹（图2j）。此外，顺利获得CLSM观察到M1EVs和OMVs融合成新的脂质囊泡，其共定位信号与FITC标记的FBFO NPs包裹在一起（图2k）。此外，如图2l所示，蛋白印迹法揭示HMs从M1EVs（TSG101、CD63、CD81以及整合素α₄β₁，以及趋化因子受体CXCR4）和OMVs（FtsZ）中继承了组分。此后，FBFO@HM NPs与aOPN抗体结合，取得FBFO@HM@aOPN。具体而言，第一时间，苯甲醛-PEG2000-NHS连接剂与aOPN的氨基末端反应，形成aOPN-PEG2000-BD。然后，aOPN-PEG2000-BD与DBCO-PEG5-NH₂连接，形成酸敏感的苯甲酸亚胺键，合成aOPN-PEG2000-DBCO（图1c），这使得aOPN能够在酸性TME（pH 6.5）中控制释放。顺利获得Dil标记的HM和Alexa Fluor 647标记的aOPN的共定位证实了FBFO@HM上成功结合了aOPN（图2m）。透射电子显微镜（TEM）图像显示FBFO@HM@aOPN呈现出具有内核和外壳的均匀球形纳米结构（图2n）。随后，顺利获得ELISA测量透析液中的aOPN抗体水平，验证了aOPN和FBFO@HM之间苯甲酸亚胺键对酸性环境的响应性，结果表明在pH 6.5时aOPN抗体的释放量大于pH 7.4时（图2o）。此外，顺利获得ESR（图2h）和MB降解实验（图2p）验证了FBFO@HM@aOPN NPs介导的光降解过程中ROS（·OH和·O₂⁻）的产生。随后，研究了FBFO@HM@aOPN NPs在不同pH值下催化H₂O₂分解产生O₂的能力。与FBFO一样，FBFO@HM@aOPN NPs在激光照射下产生ROS（图2p）和O₂（图2q）。这些观察结果表明，成功制备了具有光增强双酶活性的FBFO@HM@aOPN生物杂化系统，能够增强PDT的疗效。

图2.a FBFO纳米颗粒尺寸和形态均匀的透射电子显微镜（TEM）图像，比例尺：100 nm。b FBFO纳米颗粒的元素分布图，比例尺：100 nm。cFe₃O₄和FBFO纳米粒子的XRD图谱。d Fe₃O₄和FBFO纳米粒子的紫外-可见/近红外漫反射光谱。e FBFO工作机理示意图。f Fe₃O₄和FBFO纳米粒子对MB的降解效果。g Fe₃O₄和FBFO纳米粒子的氧气（O2）生成曲线。h不同组别电子自旋共振（ESR）谱图。i氨基化（N3）修饰的M1EVs与DBCO-Cy5.5孵育后的代表性流式细胞术及定量分析。j CLSM分析，显示N₃修饰的M1EVs与DBCO-Cy5.5结合后的结果，比例尺：50 nm。k CLSM分析显示M1EVs与外膜囊泡（OMVs）的共定位，比例尺：50 nm。l蛋白质印迹法显示HM从M1EVs（TSG101、CD63、CD81及整合素α4β1，以及趋化因子受体CXCR4）和OMVs（FtsZ）中继承成分。m CLSM图像分析显示HM与aOPNs的共定位，比例尺：100 nm。n FBFO@HM@aOPN纳米颗粒尺寸和形态均匀的TEM图像，比例尺：100 nm。o ELISA定量检测不同pH值下抗OPN的释放量。p. 在指定条件下，FBFO@HM@aOPN对MB的降解和q. O₂生成曲线

（2）体外催化活性和治疗效果

为了评估FBFO@HM@aOPN NPs的PDT效果，使用CT2A GBM细胞系进行了一系列体外实验。在随后的实验中，将受试者分为7组（I: PBS, II: aOPN, III: FBFO, IV: FBFO@OMV, V: FBFO@M1EV, VI: FBFO@HM, 和 VII: FBFO@HM@aOPN）。多种相互作用分子存在于M1EV膜表面，包括整合素α4β1，可以与内皮细胞和GBM细胞上高表达的Icam1或Vcam1配体分子相互作用，促进膜包裹的纳米粒子穿过血脑屏障（BBB）以及主动靶向肿瘤细胞。随后使用Cy5.5标记的FBFO来评估其被CT2A GBM细胞的摄取。FBFO@HM@aOPN NPs处理的GBM细胞中Cy5.5的荧光强度更高，FBFO@M1EV-NPs或FBFO@HM-NPs处理的细胞也观察到类似的荧光信号趋势。此外，当用抗Icam1/Vcam1抗体阻断时，摄取效率急剧下降（图3a），表明M1EVs赋予了NPs主动靶向肿瘤细胞的能力。随后使用2,7’-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为探针评估细胞内ROS的产生。如图3b所示，FBFO@HM@aOPN处理组的绿色荧光强度略高于对照组。值得注意的是，FBFO@HM@aOPN联合激光照射组在所有组中呈现出最强的绿色荧光强度。这些结果表明FBFO@HM@aOPN可以借助肿瘤靶向M1EVs将FBFO高效送入肿瘤细胞，并在激光照射下产生大量的ROS，增加癌细胞对氧化损伤的敏感性。为了评估FBFO@HM@aOPN的细胞毒性，对CT2A GBM细胞进行了标准的CCK8实验。与其它组相比，FBFO@HM@aOPN联合激光照射组的肿瘤细胞存活率显著降低（图3c）。缺氧对癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化（EMT）有深远影响，从而强烈影响它们的生物学行为和恶性程度。因此，缓解缺氧条件可以抑制肿瘤细胞的抗氧化能力，促进氧化损伤。如图3d所示，常氧条件下处理的GBM细胞比缺氧条件下处理的细胞抑制率高得多。即使在缺氧条件下，FBFO@HM@aOPN联合激光照射组的肿瘤细胞存活率也显著降低，表明FBFO@HM@aOPN的PDT可以克服缺氧微环境的限制。此外，FBFO@HM@aOPN NPs的光诱导杀伤效率明显大于其他治疗（图3e）。这些结果表明FBFO@HM@aOPN NPs具有优异的体外催化PDT效率。细胞内ROS（·OH）的大量积累可以增加膜脂质过氧化，诱导细胞铁死亡。为了验证这一假设，顺利获得测量丙二醛（MDA）水平评估细胞内脂质过氧化，这是铁死亡早期的指标。如图3f所示，FBFO@HM@aOPN处理显著增加了脂质过氧化，随后的激光照射进一步加剧了脂质过氧化。细胞出现肿胀、起泡，最终破裂（图3g），这是铁死亡的迹象。

铁死亡被认为是一种免疫原性细胞死亡（ICD），其特征是释放损伤相关分子模式（DAMPs），包括膜钙网蛋白（CALR）、高迁移率族蛋白1（HMGB1）和腺苷酸三磷酸（ATP）。与的预期一致，FBFO@HM@aOPN组的细胞膜上CALR表达明显增加（图3g）。此外，FBFO@HM@aOPN导致GBM细胞释放的ATP和HMGB1增加（图3h, i），从而诱导ICD并为APCs给予丰富的抗原，从而促进T细胞的浸润和激活（图3j）。

图3. a流式细胞术分析显示CT2A胶质母细胞瘤细胞对Cy5.5标记的FBFO的内化情况。右侧图像为Cy5.5-positive细胞定量分析结果。b CT2A胶质母细胞瘤细胞经DCFH-DA染色显示NP诱导的ROS生成，比例尺：200 μm。c CT2A胶质母细胞瘤细胞经不同制剂处理后的细胞活力。d 低氧/常氧条件下的细胞活性。e流式细胞术分析CT2A胶质母细胞瘤细胞经不同制剂处理后在660 nm辐照下的Annexin V-FITC/PI凋亡情况。f 660 nm辐照下不同制剂处理的CT2A胶质母细胞瘤细胞脂质过氧化水平，采用丙二醛（MDA）检测试剂盒测定。g CALR与Hoechst共染色的CT2A细胞经660 nm辐照后共聚焦激光扫描显微镜图像。比例尺：50 μm。检测660 nm辐照后不同制剂处理的CT2A胶质母细胞瘤细胞培养上清液中释放的人源HMGB1和iATP。j FBFO@HM@aOPN诱导ICD的示意图及增强免疫治疗的潜在机制

（3）FBFO@HM@aSPP NPs的体外促巨噬细胞M1极化能力

作者系统地研究了FBFO@HM@aOPN对巨噬细胞的影响。使用Cy5.5标记的FBFO来研究其被MΦ细胞的摄取，与对照组相比，HM包裹的NPs的Cy5.5荧光强度更高，且这种摄取可以顺利获得中和Icam1/Vcam1抗体阻断，表明M1EVs有助于将FBFO NPs递送至MΦs（图4a）。此外，与对照组相比，FBFO处理组的DCFH-DA荧光强度略有增加。然而，FBFO HM包裹的NPs呈现出最强的绿色荧光强度（图4b），表明FBFO NPs可以被有效地递送至巨噬细胞，并在激光照射下产生ROS。为了详细探索FBFO@HM@aOPN处理的巨噬细胞的极化状态，顺利获得RNA测序（RNA-seq）分析了经PBS（对照）或FBFO@HM@aOPN处理的MΦ细胞的转录组，结果揭示了两组之间的显著差异（图4c）。火山图显示M1巨噬细胞标记物（Cd86、Cd80、Tnf和Il6）明显上调，而M2巨噬细胞标记物（Cd206，由Mrc1基因编码，以及Arg1）显著下调（图4c）。此外，基因本体（GO）分析显示，与上调基因相关的富集生物学过程（GO BP）主要与免疫过程有关，包括天然免疫反应、对I型干扰素（Ifn-β）和II型干扰素（IFN-γ）的细胞反应、免疫效应过程的正向调控以及NF-κB信号转导通路的规范。下调基因主要与基质重塑等生物学过程有关（图4d）。此外，基因集富集分析（GSEA）显示，与上调基因相关的抗原呈递途径和T细胞趋化途径在基因表达中富集（图4e）。总体而言，转录组分析显示，FBFO@HM@aOPN处理组的大多数DEGs与M1巨噬细胞极化以及IFN介导的天然免疫反应高度相关。与对照处理相比，FBFO@OMV和FBFO@M1EV处理均显著上调这些标记物，而FBFO@HM@aOPN处理组的效果最为显著（图4f）。这些结果证实了FBFO@HM@aOPN NPs促进巨噬细胞从M0型向M1型极化的能力。在抗原交叉呈递过程中，肿瘤抗原被APCs（如巨噬细胞）内化，随后呈递给主要组织相容性复合体I类（MHC-I）分子，从而激活CD8+ T细胞。流式细胞仪分析显示，FBFO@HM@aOPN处理的巨噬细胞MHC-I分子表达增加（图4g）。此外，使用表达卵清蛋白抗原（OVA）的CT2A（CT2A-OVA）作为模型系统时，流式细胞仪定量结果显示，FBFO@HM@aOPN刺激的巨噬细胞中与MHC-I相关的SIINFEKL肽显著上调（图4h），从而为顺利获得这些FBFO@HM@aOPN刺激的TAMs激活特异性CD8+ T细胞奠定了基础。由于抗肿瘤免疫涉及将M2巨噬细胞重极化为M1巨噬细胞，进一步研究了FBFO@HM@aOPN NPs将M2样巨噬细胞极化为M1巨噬细胞的能力。发现FBFO@HM@aOPN NPs显著降低了M2样巨噬细胞的比例，顺利获得Cd206标记物表达检测（图4i），表明FBFO@HM@aOPN NPs具有强大的能力将M2样巨噬细胞重极化。为了证实FBFO@HM@aOPN NPs对巨噬细胞极化效果的普适性，从小鼠中分离出髓系细胞，并进一步培养和分化为骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）（图4j）。顺利获得流式细胞术和qPCR分析检测M1和M2巨噬细胞标记物的表达水平。如图4k–m所示，FBFO@HM@aOPN NPs显著上调了M1巨噬细胞标记物和抗原呈递处理相关因子的表达水平。此外，FBFO@HM@aOPN组中M2巨噬细胞标记物CD206的表达被强烈下调（图4n）。这些结果表明FBFO@HM@aOPN NPs能够在体外显著地将M0和M2样巨噬细胞极化为M1表型。为了进一步分析FBFO@HM@aOPN NPs如何促进巨噬细胞极化，探索了其中涉及的潜在机制。鉴于IFN产生与cGAS-STING激活之间的强关联，随后试图确认FBFO@HM@aOPN NPs是否顺利获得STING途径调节巨噬细胞中的免疫反应。GSEA结果也显示，与PBS处理的Raw264.7细胞相比，FBFO@HM@aOPN处理组中上调的基因在顺利获得STING途径的细胞溶质DNA感应途径中显著富集（图4o）蛋白印迹结果进一步证实FBFO@HM@aOPN有效增加了STING磷酸化（p-STING）水平及其下游IRF3转录活性的诱导（图4p）。

TME中的缺氧及其诱导产物是STING激活的强抑制因子。因此，FBFO@HM@aOPN诱导的STING激活可能归因于FBFO的CAT样酶活性。此外，M1巨噬细胞的极化还受到多个信号通路的调控，其中NF-κB因子是关键的转录调控因子，NF-κB可被多种ROS和LPS/TLR4信号转导途径激活。富集分析也显示，与FBFO@HM@aOPN处理组相比，上调基因在NF-κB和Toll样受体信号通路中显著富集（图4d, o）。如预期所示，FBFO@HM@aOPN处理的巨噬细胞中p65磷酸化水平升高（图4p）。结果显示FBFO@HM@aOPN顺利获得激活cGAS-STING和NF-κB通路有效地促进了M1巨噬细胞的极化（图4q）。总体而言，这些体外结果表明FBFO@HM@aOPN能够顺利获得促进巨噬细胞M1极化、增加TAMs的抗原呈递能力以及协同减轻TME免疫抑制来克服当前免疫治疗中的挑战，为增强体内的抗肿瘤免疫反应给予了有希望的机会。

图4. a. 流式细胞仪分析显示Raw264.7细胞摄取Cy5.5标记的FBFO。b. CLSM图像显示Raw264.7细胞内ROS产生。标尺为200微米。c. 火山图显示Raw264.7细胞经PBS或FBFO@HM@aOPN处理后的与巨噬细胞极化相关的DEGs表达谱。d. GO BP和（e）GSEA富集分析显示PBS和FBFO@HM@aOPN处理的Raw264.7细胞之间DEGs的结果。f. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下Raw264.7细胞中CD80+CD86+的比例。g. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下Raw264.7细胞中MHC I+的比例。h. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下Raw264.7细胞中H-2Kb/SIINFEKL+的比例。i. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下Raw264.7细胞中CD206+的比例。j. 建立BMDMs的方法。k. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下BMDMs中CD80+CD86+的比例。l. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下BMDMs中MHC I+的比例。m. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下BMDMs中H-2Kb/SIINFEKL+的比例。n. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下BMDMs中CD206+的比例。o. GSEA富集分析显示PBS和FBFO@HM@aOPN处理的Raw264.7细胞之间DEGs的结果。p. 蛋白印迹分析显示Raw264.7细胞和BMDMs经不同配方处理后的STING-IRF3和NF-κB p65磷酸化水平。q. FBFO@HM@aOPN将巨噬细胞重编程为M1样表型的机制示意图

（4）3D肿瘤球体模型中的肿瘤抑制

M1巨噬细胞能够吞噬肿瘤细胞，从而抑制恶性肿瘤的进展。为了确定FBFO@HM@aOPN是否促进巨噬细胞吞噬作用，将经过不同配方处理的tdtomato标记的CT2A细胞与经过不同配方预处理的EGFP标记的RAW264.7细胞共培养。CLSM和流式细胞仪分析显示，与对照细胞相比，经过NPs预处理的RAW264.7巨噬细胞吞噬了更多的癌细胞（图5a, b）。随后，使用3D肿瘤模型，即顺利获得共培养M2样巨噬细胞和CT2A GBM细胞建立的多细胞肿瘤球体（MCTS），来研究FBFO@HM@aOPN穿透肿瘤的能力（图5c）。为了确定FBFO@HM@aOPN是否增强靶向FBFO的递送，将MCTS与Cy5.5标记的FBFO共孵育6小时。利用CLSM在Z-stack扫描模式下评估穿透效果（图5d）。如图5e所示，在FBFO@HM@aOPN处理组中，红色荧光明显扩散到MCTS的内部。然而，在FBFO处理组中，红色荧光大多分布在MCTS的外围。这些结果表明，在TME的响应下，FBFO@HM@aOPN显著促进了PDT药物深入肿瘤组织的穿透，克服了实体瘤中的自然物理屏障。顺利获得分析MCTS中的缺氧水平和巨噬细胞表型来研究FBFO@HM@aOPN重塑异常TME的潜力。经过12小时的FBFO@HM@aOPN处理后，使用缺氧绿色试剂对MCTS内部的缺氧水平进行免疫荧光染色。FBFO@HM@aOPN处理的肿瘤球体显示出最弱的绿色荧光强度，即使在核心区域也是如此。相比之下，PBS或游离FBFO处理的肿瘤球体显示出强烈的绿色荧光信号（图5f），证实了FBFO@HM@aOPN有效缓解了肿瘤缺氧。此外，FBFO@HM@aOPN组的球体最终体积显著低于PBS组（图5g）。根据流式细胞仪和ELISA分析，FBFO@HM@aOPN处理有效促进了M2样巨噬细胞向M1样表型的极化（图5h, i），表明FBFO@HM@aOPN调节实体瘤中免疫抑制微环境的能力。这些结果表明，FBFO@HM@aOPN可以在重塑缺氧和免疫抑制微环境的同时，成功穿透自然物理肿瘤屏障，为增强体内抗肿瘤免疫反应给予了有希望的机会。

图5. a. CLSM图像显示CT2A GBM细胞（红色）被重编程的M1巨噬细胞（绿色）杀伤。标尺为100 μm。b. 流式细胞仪分析显示重编程的M1 BMDMs杀伤CT2A GBM细胞的比例。c. 体外3D肿瘤模型（MCTS）制备和（d）评估穿透潜力的示意图。e. Z-stack CLSM图像显示经过6小时孵育后，不同配方处理的Cy5.5标记的FBFO NPs在CT2A-BMDM多细胞球体中的穿透情况。标尺为250 μm。f. Z-stack CLSM图像显示用缺氧绿色试剂染色的CT2A-BMDM多细胞球体（MCTSs），以指示缺氧程度。标尺为250 μm。g. MCTSs体积的代表性照片（左）和不同配方处理的MCTSs在第7天的体积直方图。标尺为200 μm。h. 流式细胞仪分析显示不同配方处理下MCTSs中CD206+ BMDMs的比例。i. ELISA检测MCTSs培养上清液中IFN-β、IL-6、TNF-α、CCL5和CXCL10的浓度

（5）体内生物分布、生物相容性和抗肿瘤作用

M1EV膜上的特定蛋白，包括整合素α4和β1，已知对于促进BBB穿透至关重要。为了评估FBFO@HM@aOPN生物杂交递送系统渗透BBB的能力，使用了Transwell™共培养系统，其中bEnd.3细胞在上室培养，而原代BMDMs和CTA2细胞在下室培养（图6a）。在上室中培养的bEnd.3细胞形成了一个完整的单层，其跨内皮电阻（TEER）为200−300 Ω·cm（图6b）。观察到FBFO@HM@aOPN-NPs的BBB穿透能力与FBFO@M1EV NPs大致相同，但后者可被抗ICAM1/VCAM1阻断（图6c），表明FBFO@HM@aOPN NPs能够更好地穿透BBB。为了确认M1EV膜包裹是否促进FBFO在GBM组织中的积累，将Cy5.5标记的FBFO系统注入表达荧光素酶CT2A（CT2ALuc）的小鼠，并实时监测Cy5.5荧光。在注射后6小时，接受FBFO@HM@aOPN-NPs处理的小鼠大脑中观察到更强的红色荧光信号，且该信号在48小时内仍可检测到（图6d），在FBFO@M1EV-NPs或FBFO@HM-NPs处理的小鼠肿瘤部位也观察到类似趋势的荧光信号（图6d）。离体荧光图像（图6e）和对肿瘤负荷大脑及主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的定量荧光强度分析也显示FBFO@HM@aOPN相对于肿瘤大小有大量积累，表明FBFO@HM@aOPN能够穿透BBB并在肿瘤中积累。上述结果表明，FBFO@HM@aOPN具有合适的肿瘤靶向能力、肿瘤保留能力和生物相容性。进一步在体内评估了FBFO@HM@aOPN的抗肿瘤效果。在肿瘤接种后的第六天，将CT2A肿瘤荷载小鼠随机分为7组，然后接受各种处理（图6g）。顺利获得7天间隔的生物发光成像陆续在监测肿瘤生长，以评估抗肿瘤效果。与PBS组中肿瘤的快速生长相比，单药治疗组显示出适度的肿瘤抑制效果，而FBFO@HM@aOPN组显示出显著的肿瘤抑制效果（图6h, i），这可能归因于PDT诱导的肿瘤细胞杀伤和TME调节的联合效应。所有肿瘤荷载小鼠在实验结束时被处死，并对肿瘤切片进行H&E、Ki67和CD44染色，以深入研究抗肿瘤效果。结果揭示了FBFO@HM@aOPN治疗组中肿瘤细胞生长受到显著抑制，且细胞外基质蛋白产生减少（图6j–l）。免疫荧光图像清楚地显示FBFO@HM@aOPN处理的肿瘤中CALR暴露增加（图6m），表明在体内成功诱导了免疫原性细胞死亡。总的来说，这些结果表明FBFO@HM@aOPN NPs在体内具有优越的抗肿瘤能力。

图6. a. 体外BBB模型示意图。b. 在体外BBB模型中，不同时间点孵育后TEER（Ω·cm²）值。c. 顺利获得检测顶室和底室中的Cy5.5荧光强度确定不同配方的运输比。d. 尾静脉注射不同配方后，CT2A荷载小鼠在不同时间点的体内Cy5.5荧光图像。e. 离体Cy5.5荧光图像（左）和f. 定量直方图（右）显示CT2A荷载大脑和主要器官的荧光强度。g. 在CT2A肿瘤模型中进行治疗性FBFO@HM@aSPP干预的实验设计。h. 代表性的生物发光图像（左）和荧光强度定量（右），以及i. Kaplan–Meier生存曲线，显示表达荧光素酶的CT2A荷载小鼠接受不同处理的结果。j. H&E染色的脑肿瘤组织切片，来自接受不同处理的CT2A肿瘤荷载小鼠。标尺为2 mm。k. CLSM图像显示Ki67（标尺为50 μm）、l. CD44（标尺为20 μm）和m. CALR（标尺为20 μm）染色的脑肿瘤组织切片，来自接受不同处理的CT2A肿瘤荷载小鼠

（6）ScRNA-seq分析显示免疫重塑增加

为了进一步探究FBFO@HM@aOPN的抗肿瘤机制，在质量控制、过滤和细胞注释后，取得了十三种细胞类型（图7a）。发现肿瘤细胞的比例显著下降。值得注意的是，识别出一个高表达干扰素调节基因（如CXCL10、ISG15和干扰素诱导蛋白IFITs）的细胞群，并将其命名为恶性-IFN细胞群（图7a–c），这表明在体内触发了强烈的干扰素反应。进一步分析了FBFO@HM@aOPN治疗组中肿瘤细胞群的整体变化。差异基因分析显示，在FBFO@HM@aOPN治疗组中，恶性细胞群和恶性-IFN细胞群中分别有618个和890个基因显著上调（图7d）。随后的KEGG富集分析显示，与铁死亡、凋亡以及免疫反应相关的通路，包括TNF信号通路、顺利获得STING的细胞溶质DNA感应通路、Toll样受体信号通路和趋化因子信号通路，在上调基因中显著富集。然而，HIF-1信号通路和粘着斑等通路在下调基因中显著富集（图7e），表明FBFO@HM@aOPN能够缓解肿瘤缺氧和基质沉积。

进一步分析了FBFO@HM@aOPN治疗组中肿瘤髓系细胞和浸润T细胞群的整体变化。顺利获得降维分析，将BMDMs分为三个亚群：单核细胞、M1和M2亚群（图7f），scRNA分析显示，与PBS组相比，FBFO@HM@aOPN治疗组中肿瘤浸润BMDMs中M1巨噬细胞的比例增加，而M2巨噬细胞的比例相应减少（图7g）。此外，M1巨噬细胞标记物（CD86、Tnf、Ifnb1）、T细胞相关趋化因子（Ccl5、Cxcl10/11）和抗原呈递分子（MHC复合体）的表达上调，而M2巨噬细胞标记物（Mrc1、Arg1、Il10和Vegfa）的表达在FBFO@HM@aOPN治疗组中下调（图7h）。随后的HALLMARK富集分析显示，上调基因主要与免疫过程相关，包括天然免疫反应、对干扰素-β（IFN-β）和IFN-γ的细胞反应、炎症细胞因子的正向调控以及顺利获得NF-κB通路的Tnfa信号传导（图7i）。此外，GSEA显示，在治疗组中，与抗原呈递和吞噬作用相关的通路在BMDMs中显著富集（图7j）。

将淋巴细胞进一步分为六个亚群，即CD8+ T细胞、常规CD4+ T细胞（convCD4+T细胞）、调节性CD4+ T细胞（Tregs）、自然杀伤（NK）细胞、幼稚T细胞和一个增殖性淋巴细胞亚群（图7k）。FBFO@HM@aOPN治疗显著促进了CD8+ T细胞和NK细胞群的扩增和增殖（图7l），这可能归因于体内I型和II型干扰素通路的激活。进一步分析了与淋巴细胞效应功能最相关的九个基因的表达情况，发现它们主要在CD8+ T细胞和NK细胞群中高表达（图7m）。此外，功能富集分析显示，与T细胞激活相关的通路在上调基因中显著富集，而与免疫抑制相关的通路在治疗组的下调基因中显著富集（图7n）。气泡图显示，治疗组中效应基因的表达上调，而大多数免疫检查点基因的表达倾向于下调（图7o）。最后，顺利获得CellChat配体-受体分析分析了免疫细胞与GBM细胞之间的细胞间通讯网络，CD80/86共刺激和抗原呈递（MHC-I/II）信号通路主要由BMDMs的一个亚群和CD8+ T细胞介导（图7p），表明BMDMs可以作为激活的APCs，顺利获得抗原呈递和共刺激信号促进效应T细胞的交叉呈递，从而增强治疗组中的适应性免疫反应。综合这些发现表明，利用FBFO@HM@aOPN进行的光免疫治疗有可能顺利获得促进M1巨噬细胞、细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）和NK细胞在肿瘤内的浸润，增强先天和取得性免疫激活，从而促进免疫冷肿瘤向免疫热肿瘤的转化。

图7. a. 均匀流形近似投影（UMAP）图显示13种主要细胞类型。点代表单个细胞，颜色代表不同的细胞群。样本根据其来源（PBS和FBFO@HM@aSPP处理的GBM）进行区分。b. 两个组织组的细胞密度分布。相对细胞密度高表示为亮岩浆色。c. 条形图显示两个组织组中主要细胞类型的相对细胞比例。d. 差异基因表达分析显示治疗组与PBS组相比恶性细胞群和恶性-IFN亚群中上调和下调的基因。e. 条形图显示FBFO@HM@aSPP处理和PBS处理的恶性细胞之间DEGs的KEGG富集分析结果。f. UMAP图显示3种BMDM亚群。点代表单个细胞，颜色代表不同的细胞群。g. 两个组织组的细胞密度分布。相对细胞密度高表示为亮岩浆色。h. 点图显示M1样和M2样标记基因的表达。i. 条形图显示FBFO@HM@aSPP处理和PBS-BMDM处理细胞之间DEGs的HALLMARK富集分析结果。j. GSEA显示在治疗组中，与抗原加工和呈递以及吞噬作用的正向调控相关的基因显著富集。k. UMAP图显示6种淋巴细胞亚群。点代表单个细胞，颜色代表不同的细胞群。l. 两个组织组的细胞密度分布。相对细胞密度高表示为亮岩浆色。m. 细胞密度显示效应相关基因的表达。相对细胞密度高表示为亮岩浆色。n. 不同淋巴细胞亚群中DEGs的功能富集分析结果。颜色从蓝色到红色表示DE得分的绝对值从低到高。o. 点图显示免疫检查点和效应基因的表达。p. 在2D空间中可视化（CD80/CD86）和（MHC-I和MHC-II）通路的主要发送者和接收者。

（7）FBFO@HM@aOPN和ICB联合治疗可预防术后GBM复发

在临床实践中，手术干预被广泛认为是早期实体瘤的主要治疗选择。然而，由于手术后残留的肿瘤细胞，GBM几乎在所有患者中都会在切除部位周围复发。FBFO@HM@aOPN促进了干扰素刺激基因的转录，I型和II型干扰素均能上调肿瘤细胞和BMDMs表面的PD-L1表达，从而增加肿瘤细胞的免疫逃逸程度。如预期所示，单细胞相互作用数据的分析显示，在FBFO治疗期间，肿瘤细胞与BMDM之间以及T细胞之间的PDL1-PD1通路被上调（图8h）。随后探索了FBFO@HM@aOPN与抗PD1抑制剂联合是否能延缓肿瘤复发。手术过程和治疗方案如图8i所示。顺利获得H&E染色对肿瘤切除腔和残留肿瘤病灶进行成像（补充图12a）。顺利获得Luci+ CT2A细胞的生物发光（BLI）信号监测肿瘤复发。FBFO@HM@aOPN治疗的肿瘤的BLI信号显著降低（图8j, k）。与抗PD1（aPD1）抗体联合进一步增强了肿瘤抑制效果（图8j, k）。此外，接受FBFO@HM@aOPN NPs和aPD1抗体联合治疗的小鼠的生存率显著高于其他配方治疗的小鼠（图8l）。在FBFO@HM@aOPN和aPD1抗体联合治疗后，所有小鼠在第100天时均存活（图8l）。随后研究了从不同组收集的肿瘤中的浸润性淋巴细胞。如图8m所示，FBFO@HM@aOPN组和联合治疗组中T细胞、IFNγ阳性T细胞和GZMB阳性CTLs的比例显著增加。有趣的是，FBFO@HM@aOPN与αPD1抗体联合治疗组对肿瘤再挑战表现出最强的抵抗力。一起，这些数据表明，FBFO@HM@aOPN与ICB疗法的联合是一种高度个性化的治疗策略，有助于预防肿瘤复发。

图8. a. 流式细胞仪分析显示CT2A荷载脑组织中f4/80+ CD45+细胞中（左侧）CD86+、（中间）MHC I+和（右侧）CD206+的比例。流式细胞仪分析显示CT2A荷载脑组织中CD45+细胞中b. CD3+ T细胞、c. NK1.1+ CD3- NK细胞、d. CD3+ CD8+ TILs和e. GZMB+ TILs的比例。流式细胞仪分析显示CT2A荷载脾脏中f. 中央记忆T细胞（TCM, CD3+CD44+ CD62L+）和g. 效应记忆T细胞（TEM, CD3+ CD44+ CD62L-）的比例。h. 气泡图显示PD-1/PD-L1活性（由TAMs和寄生虫释放）与PD-L1受体表达（由淋巴细胞亚群表达）在处理和未处理样本之间的相互作用。i. 术后复发挑战的CT2A GBM肿瘤的实验设计示意图。J. 代表性生物发光图像和k. 荧光强度定量（右侧），以及l. Kaplan–Meier生存曲线，显示表达荧光素酶的CT2A荷载小鼠接受不同处理的结果。m. 流式细胞仪分析显示CT2A荷载脑组织中CD45+细胞中（左侧）CD3+ T细胞、（中间）IFN-γ + T细胞和（右侧）GZMB+ TILs的比例