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为了以增加细胞产生和分泌 GAGs 的能力，或直接提高其在关节中的保留量。良渚实验室/浙江大学医学院欧阳宏伟教授团队，联合美国哥伦比亚大学 Kam Leong 教授和浙江大学魏威研究员团队受到分子机器概念的启发，探索了带电分子与 GAGs 的化学相互作用，以影响其空间分布和生物合成程序。研究选择了阳离子聚合物与 GAGs 进行相互作用。顺利获得筛选多种阳离子聚合物，发现聚凝胺（HDMBr）能够富集 GAGs 并促进软骨再生。HDMBr 能够吸引细胞外的 GAGs 形成软骨生成微环境。在细胞内，HDMBr 促进了 GAGs 的组装，并提高了基质分泌的膜运输效率。在体内，HDMBr 有效诱导了软骨损伤的内源性组织再生，并促进了 OA 中的基质重塑。该研究于2025年6月25日以《A cationic polymer drives glycosaminoglycan assembly and secretion for preclinical osteoarthritis therapy》为题，发表于《Science Translational Medicine》上，浙江大学爱丁堡大学联合学院研究员陈奕姗为本文的第一作者，浙江大学医学院孙伟博士、文雅博士，良渚实验室“百人计划”研究员王小召为本文的共同第一作者。（DOI：10.1126/scitranslmed.adl5623）

机制示意图：HDMBr如同分子机器般驱动GAG高效分泌和积累。在细胞内，HDMBr 促进 GAG 组装，诱导高浓度 GAG 凝聚物，并提高细胞内运输效率；在细胞外，HDMBr 锚定细胞周GAG，形成软骨发生微环境

（1）HDMBr 体外促进人类 MSC 软骨形成

该研究假设阳离子聚合物可能影响MSC的软骨形成，因此比较了PEI、PAMAM-G3、HDMBr、PLL、PDL和PLO（图S1A，表S1）。结果显示，HDMBr处理组的阿新蓝染色最强，提示GAG生成显著增加（P=0.0103）（图1A、B）。在标准培养基中，HDMBr进一步促进MSC形成软骨样结节，并增强阿尔新蓝和番红O染色（P<0.05）（图1C、D）。在仅含ITS或TGF-β3的简化培养基中，HDMBr依然增强了软骨形成，作用不依赖特定因子（图S1B）。促进软骨形成的HDMBr剂量（1–3 μg/ml）远低于转染常用剂量（8–10 μg/ml），且细胞毒性较低（图S1C、D），与基础培养基相比未显著扰乱电荷环境（表S2）。

图 1. HDMBr 体外促进人类 MSC 软骨形成。（A和B）候选聚合物 [阳离子聚合物（1 μg/ml）溶于简化的软骨形成培养基，12 天] 处理的 MSCs 中阿尔新蓝染色强度的代表性图像 (A) 和定量分析 (B)。比例尺，100 μm (A)。数据以箱线图的形式呈现，显示中位数、四分位距以及最小值和最大值的晶须 (B)。顺利获得单因素方差分析和 Dunnett 事后检验进行分析。 每组n = 5。（C和D）在标准分化培养基中，HDMBr 处理的 MSC 软骨形成的番红 O 和阿尔新蓝染色强度的代表性图像 (C) 和定量分析 (D)。细胞用 HDMBr（1 或 3 μg/ml）处理 14 天。比例尺，50 μm。数据以平均值±SEM 的形式呈现。点代表单个强度测量值。采用单因素方差分析和 Dunnett 事后检验进行分析。 每组n = 9。（E和F）经 HDMBr 处理的 MSC 类器官（3 μg/ml，28 天）的 PRG4、ACAN、COL2 和 COL1 的免疫荧光染色 (E) 和定量分析 (F)。白框表示下方放大的区域。比例尺，100 μm。数据以平均值 ± SEM 表示。点表示代表性图像中染色强度的单个测量值。采用非配对双尾学生t检验进行分析。类器官数量 = 每组 3 个。* P  < 0.05、** P  < 0.01 和 *** P  < 0.001

图S1

（2）HDMBr 增加人类软骨类器官中蛋白多糖的表达

为评估HDMBr对特定ECM成分的调控作用（图S2A），顺利获得DMMB和羟脯氨酸法分别检测GAG和胶原含量。结果显示，HDMBr显著增加了GAG（P=0.0327），但对胶原无明显影响（P=0.6679；图S2B）。在3D类器官培养中，HDMBr处理组表现出更强的番红O和阿新蓝染色，而未见caspase-3阳性细胞凋亡（图S2C–E）。进一步免疫荧光检测发现，PRG4和ACAN的表达面积与强度均显著升高（P<0.05；图1E、F），而COL2无明显变化（P=0.4551和0.3966）。COL1染色强度无差异，但其染色面积减少（P=0.3132和0.0007；图1E、F）。综上，HDMBr可增强GAG沉积并上调蛋白聚糖表达。

图S2

（3）HDMBr 与细胞周围基质相互作用，形成富含 GAG 的微环境

该研究推测带正电荷的HDMBr可能顺利获得静电作用与带负电荷的GAG或质膜相互作用（图2A）。以ACAN的主要成分硫酸软骨素A（CS-A）为代表，在CS涂层培养皿中发现单独的CS不促进细胞粘附，但加入HDMBr显著增强了MSC在其表面的粘附（P<0.05；图2B、C）。然而，过量CS会削弱HDMBr对软骨形成的促进作用[HDMBr（3 μg/ml）+CS（125 μg/ml），P=0.0028]（图2D），提示二者之间存在有效相互作用。SEM显示，HDMBr处理的类器官表面更光滑，呈现凝胶状基质，与天然软骨更为接近（图2E、F）；拉曼光谱进一步证实了类器官中CS和HDMBr的存在（图S2F、G）。在仿生GelMA/CS/HA水凝胶模型中，HDMBr显著提高了MSC对软骨样ECM成分的粘附（图2H、I）。培养7天后，HDMBr组形成更大、更致密的软骨结节，并伴随更强的ACAN表达（图2H–J）。这些结果表明，HDMBr顺利获得增强细胞-ECM相互作用和细胞聚集，促进了MSC的软骨形成（图2I）。

图2. HDMBr 吸引细胞周围基质，形成富含 GAG 的微环境。 (A) 示意图：HDMBr 与带负电荷蛋白多糖相互作用。(B, C) 实验设计及定量：MSC在未处理、CS包被及HDMBr处理（3 μg/ml）CS包被培养皿上的粘附情况（单因素方差分析+Tukey检验，n=4）。(D) HDMBr（1、3 μg/ml，10天）在不同CS浓度下对MSC软骨形成的阿尔新蓝染色强度影响（单因素方差分析+Dunnett检验，n=8）。(E) 对照与HDMBr处理（3 μg/ml，28天）MSC类器官表面SEM图像及局部放大。比例尺：200 μm、5 μm、2 μm。(F) 健康兔关节软骨SEM图像及局部放大。比例尺：20 μm、5 μm。(G) MSC在HDMBr-Gel上培养示意图。(H) 第7天MSC在对照与HDMBr-Gel上的聚集体的番红O和F-肌动蛋白染色。比例尺：100 μm。(I) MSC粘附（n=6–7）、聚集（n=10）和ACAN染色强度（n=10）的定量（t检验）。(J) 水凝胶中MSC聚集体ACAN免疫染色的三维重建图像。比例尺：100 μm。数据以均值±SEM表示。(C) 点代表单个细胞样本，(I) 点代表独立图像的单个测量值（n=3）。ns，不显著；*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

（4）蛋白质组学揭示 HDMBr 促进细胞内 GAG 的产生

为解析HDMBr对MSC蛋白质表达的影响，该研究对简化软骨培养基中培养7天的MSC进行了蛋白质组学分析，鉴定出两组间超过280个差异蛋白（图S3A，表S3）。在ECM相关蛋白中，核心蛋白聚糖Decorin显著上调（P=0.0415），PRG4结合蛋白LGALS3增加（P=0.0147），而囊泡运输相关的ANXA2和ANXA6也显著升高（P<0.05）（图S3B）。相反，COL1、COL5A2和COL14A1等纤维化相关胶原显著下调（P<0.01），与免疫染色结果一致（图S3B）。在细胞内蛋白中，HDMBr组显示出与运输、分化和蛋白质合成相关的分子升高（图S3C），GO分析提示其与代谢和膜运输显著相关（图S3D）。

图S3

STRING分析显示，上调蛋白集中于蛋白质合成、运输、细胞骨架和代谢网络（图3A）。值得注意的是，糖酵解相关蛋白（GPI、HK1）和戊糖磷酸途径蛋白（TALDO1、TKT）均上调，提示其可能促进GAG前体的合成（图3B，表S3）。此外，VCL、ACTN1、ANXA2和SURF4等关键分子升高，表明HDMBr增强了GAG的运输与分泌（图3B）。综上，HDMBr诱导了广泛的蛋白质组学变化，可能顺利获得调节代谢和膜运输促进GAG合成与分泌。

图3. HDMBr 顺利获得促进细胞内运输来驱动生产性基质分泌。 (A) HDMBr处理MSCs的蛋白质组学分析中上调蛋白质的网络图 [1 μg/ml，简化培养基，7天，n=3]。(B) 上调蛋白的热图，涉及GAG前体合成（左上）、分泌途径（左下）及GAG合成与运输的示意图（右），色标表示相对表达，n=3。(C) TEM图像显示HDMBr诱导的表型：粗糙的细胞膜（粉色线）、含浓缩颗粒的分泌囊泡（区域1，粉色箭头；v）、膜周颗粒积聚（区域1和2，粉色箭头；Ma）及增强的细胞骨架聚合（区域3；Cy），比例尺2 μm（第1列）、200 nm（第2–4列），n=3。(D, E) 对照与HDMBr处理MSCs的分泌血管示意图(D)及TEM图像(E)，粉色箭头标示浓缩基质颗粒（参见图S5F），比例尺500 nm（第1列）、250 nm（第3列），n=3

（5）HDMBr 顺利获得促进细胞内运输来促进基质分泌

为探究HDMBr在细胞内促进GAG生成的机制，第一时间检测了葡萄糖摄取。结果显示，HDMBr显著增加MSC的葡萄糖摄取，PEI和PLL也有类似作用（图S4A），提示该效应与细胞膜通透性相关（表S1，图S4B）。然而，HDMBr并未改变高尔基体形态或β4GalT1活性（图S4C–E）。免疫荧光结果显示，GAG延长相关酶CHPF/CHSY2表达升高（图S4F、G），但PAPSS2、PAPS水平及硫酸盐掺入均无显著变化（图S4F–L），提示HDMBr对GAG修饰作用有限。

图S4

鉴于HDMBr可调控膜曲率和囊泡运输，该研究聚焦于分泌途径。蛋白质组学提示ANXA2表达上调（图3B，图S3B），其与肌动蛋白丝协同参与囊泡外排。实验中ANXA2和肌动蛋白均显著增加（图S5A、B），且在已公开数据集中Anxa2于软骨分化中期高表达（图S5C）。siRNA敲低ANXA2显著抑制MSC软骨形成，且HDMBr无法逆转（图S5D、E），表明ANXA2是HDMBr介导的GAG富集关键因素。

图S5

超微结构观察进一步证实了分泌活性增强：TEM显示HDMBr处理组细胞膜更粗糙，并伴随分泌囊泡和细胞骨架聚合度增加（图3C）。值得注意的是，仅在HDMBr组观察到囊泡和细胞膜附近大量致密球形颗粒（图3C–E，图S5F、G），提示其可能为局部凝聚的基质成分。

综上，HDMBr顺利获得调控膜通透性、上调ANXA2并促进囊泡运输，增强了分泌途径，从而促进基质成分的局部聚集和软骨形成。

（6）HDMBr 驱动富含 GAG 的凝聚物的组装

HDMBr可顺利获得增加囊泡数量及负载效率，促进GAG分泌。由于多糖在局部浓度超过阈值后会自然缩合，该研究团队推测HDMBr诱导GAG形成浓缩颗粒。免疫组化结果表明，HDMBr（而非PEI或PLL）显著增加了MSC内CS缩合物的积累（P<0.01；图4A–C，图S6A），与组织学染色一致。体外实验中，HDMBr在CS溶液中诱导相分离，生成球形液滴或颗粒（图4D–F，图S6B），表现出一定流动性；相比之下，PEI和PLL形成不规则沉淀。由此推测，HDMBr的凝聚效应对细胞的潜在损害可能低于其他阳离子聚合物。

STEM-EELS进一步证实了细胞内外的颗粒均含有HDMBr和CS（图4G–J，图S6C），表明这些结构为CS-HDMBr复合物。进一步对比发现，在常见ECM分子中，仅CS和HS可与HDMBr形成颗粒，其中CS产生的数量更多（图S6D、E），提示其为主要成分。

分子对接与MD模拟进一步支持了实验观察，显示CS与HDMBr具有较高结合亲和力（-21.6312）（图S6F），并在模拟过程中逐渐聚集成较大簇，依赖静电力和范德华力等相互作用（图4K–M，图S6G、H）。综上，HDMBr顺利获得促进CS/HS与其组装成浓缩球形颗粒，提高了局部GAG浓度，从而为增强分泌效率给予了潜在机制。

图4. HDMBr促进富含GAG的缩合物的组装。 (A, B) CS免疫染色的3D重建与放大图像及颗粒面积量化示例，比例尺10 μm (A)、2 μm (B)。(C) 定量分析不同聚合物处理（1 μg/ml，7天）后MSCs中球状CS凝聚物的数量和面积，数据为箱线图，n=4个细胞或26–31个视野。(D) 在PBS中CS与HDMBr相分离形成液滴的图像（CS 50 mg/ml；HDMBr 5或50 μg/ml），比例尺10 μm，n=6–9。(E) 含HDMBr、PEI或PLL的PBS中CS液滴/沉淀物形态，比例尺20 μm，n=3。(F) 延时成像显示液体状CS液滴的布朗运动，比例尺5 μm。(G, H) HAADF-STEM图像显示体外和细胞内形成的球形CS-HDMBr颗粒，比例尺200 nm，n=3。(I, J) STEM-EELS图像显示体外不同CS/HDMBr比例及细胞内样品中氮的分布，比例尺100 nm。(K) MD模拟快照显示不同比例下CS-HDMBr复合物的组装。(L) 分子动力学中簇数随时间变化。(M) 示意图：HDMBr作为分子组装剂诱导富含GAG的缩合物，提高运输效率而无明显细胞毒性。**P<0.01，***P<0.001

图S6

（7）低剂量HDMBr不会引起明显的毒性

为评估HDMBr在软骨修复中的潜力，该研究第一时间检测了其体内滞留情况。拉曼光谱显示，单次关节内注射后，HDMBr在28天内可在软骨和滑膜中检测到，并优先积累于软骨（图S7A–F）。生物相容性实验表明，HDMBr未在健康小鼠关节诱发显著炎症反应（图S8A），低剂量（2 μg/ml）未引起关节肿胀，高剂量在第3天导致轻度肿胀但于28天恢复（图S8B）。未检测到软骨细胞凋亡（图S8C、D），且两个剂量组均显著增加了软骨厚度（P<0.0001；图S8E、F）。在人类软骨外植体实验中，28天培养后，HDMBr未显著影响含水量、离子吸收或粘弹性质（图S11B–J），但软骨表面GAG染色增强、降解表型减少（图S12A、B），且沉淀中GAG水平显著升高（P<0.0001；图S12C、D），与MSC类器官结果一致（图1，图S2）。

综上，低浓度HDMBr在体内可安全应用，增强软骨GAG沉积而不破坏关节生理特性。

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（8）HDMBr 促进大尺寸缺损处的内在软骨再生

为评估HDMBr在软骨修复中的治疗潜力，该研究建立了兔大尺寸骨软骨缺损模型，该模型难以自愈并依赖内源性MSCs募集（图5A）。HDMBr顺利获得仿生GelMA/CS-NB/HA-NB水凝胶递送，体外检测表明其不改变水凝胶的交联、膨胀及力学性质（图S13A–D）。实验分为假手术组、损伤组、空白水凝胶组和HDMBr凝胶组。术后6周，HDMBr凝胶组出现透明样软骨样结构，基质染色增强，提示早期再生反应（图5B）。12周时，损伤组主要形成纤维组织，而凝胶组与HDMBr凝胶组均形成番红O阳性软骨；其中HDMBr组表现出更好的组织整合和富含GAG的新生软骨（图5B）。ICRS-II评分显示，HDMBr凝胶组在中层/深层再生及基底整合方面显著优于凝胶组（P<0.05；图5B、C）。免疫组织化学进一步证实，HDMBr凝胶组的新生软骨高表达ACAN与COL2，而COL1表达降低（图5D，图S13F）。μCT分析未发现显著的软骨下骨修复差异（图S13G、H）。

图5.HDMBr 促进大尺寸缺损处的软骨再生。( A ) HDMBr 可激活大型兔骨软骨缺损中的内在软骨再生。( B ) 手术后 6 周和 12 周对软骨进行番红 O 染色。箭头表示未完全愈合组织的边缘。比例尺：500 μm（第 1 行和第 4 行）、200 μm（第 2 行和第 5 行）和 50 μm（第 3 行和第 6 行）。( C ) 12 周样本的软骨修复 ICRS-II 评分。数据以平均值±SEM 表示。点代表每个样本的单独分数。顺利获得单因素方差分析和 Tukey 事后检验进行分析。* P  < 0.05、** P  < 0.01 和 *** P  < 0.001。( D ) 透明软骨标志物 ACAN 和 COL2 的免疫化学染色。比例尺：100 μm

图S13

（9）HDMBr 调节基质稳态并抑制纤维化以改善大鼠创伤后骨关节炎

在大鼠ACLT模型中（图6A），该研究比较了HDMBr与临床相关治疗（皮质类固醇、HA、MSCs）以及HDMBr联合MSCs（HD-MSC）。8周时，皮质类固醇和HA未显著改善软骨形态（图6B、C），而MSC、HDMBr和HD-MSC组均表现出关节表面保护，OARSI评分显著降低（P<0.05）。同时，ACAN表达增强（图6B、D），COL1阳性纤维化组织减少（图6D），并伴随轻度软骨下骨保护作用（图6E、F）。

图6. HDMBr 调节基质稳态并抑制纤维化以改善 OA。 (A) ACLT大鼠模型示意图，比较HDMBr与临床相关治疗；损伤于第0周建立，治疗在第2、4和6周行关节内注射。(B, C) 8周后膝关节的番红O染色及OARSI评分，单因素方差分析+Dunnett检验，比例尺200 μm，n=6–9。(D) 治疗后基质的免疫染色，灰色箭头示COL1积累，比例尺200 μm。(E, F) 微型CT及软骨下骨体积定量分析，n=6–9。(G–I) HDMBr注射增加健康大鼠的软骨厚度（n=3–4，每关节测量5个区域），比例尺200/100 μm。(C, F, I) 数据以均值±SEM表示，点代表单个样本或单次测量。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

在16周模型中，HDMBr显示出优于HA和MSC的软骨保护效果，表现为OARSI评分更低、ACAN增加、COL1减少以及软骨厚度显著增加（P<0.0001；图S15B–E）。软骨下骨影响不明显（图S15F、G）。在正常大鼠关节中，HDMBr同样增加软骨厚度（P<0.0001；图6G–I，图S16A–C），未诱发炎症或明显结构改变（图S16D，图S17A、B）。

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